Схема репарации ошибок репликации

Процесс,
позволяющий живым организмам
восстанавливать повреждения, возникающие
в ДНК, называют репарацией. Все
репарационные механизмы основаны на
том, что ДНК — двухцепочечная молекула,
т.е. в клетке есть 2 копии генетической
информации. Если нуклеотидная
последовательность одной из двух цепей
оказывается повреждённой (изменённой),
информацию можно восстановить, так как
вторая (комплементарная) цепь сохранена.

Процесс
репарации происходит в несколько этапов.
На первом этапе выявляется нарушение
комплементарности цепей ДНК. В ходе
второго этапа некомплементарный
нуклеотид или только основание
устраняется, на третьем и четвёртом
этапах идёт восстановление целостности
цепи по принципу комплементарности.
Однако в зависимости от типа повреждения
количество этапов и ферментов, участвующих
в его устранении, может быть разным.

Очень
редко происходят повреждения, затрагивающие
обе цепи ДНК, т.е. нарушения структуры
нуклеотидов комплементарной пары. Такие
повреждения в половых клетках не
репарируются, так как для осуществления
сложной репарации с участием гомологичной
рекомбинации требуется наличие
диплоидного набора хромосом.

А.
Спонтанные повреждения

Нарушения
комплементарности цепей ДНК могут
происходить спонтанно, т.е. без участия
каких-либо повреждающих факторов,
например в результате ошибок репликации,
дезаминирования нуклеотидов, депуринизации.

Ошибки
репликации

Точность
репликации ДНК очень велика, но примерно
один раз на 10⁵-10⁶ нуклеотидных
остатков происходят ошибки спаривания,
и тогда вместо пары нуклеотидов А-Т, G-С
в дочернюю цепь ДНК оказываются
включёнными нуклеотиды, некомплементарные
нуклеотидам матричной цепи. Однако
ДНК-полимеразы δ, ε способны после
присоединения очередного нуклеотида
в растущую цепь ДНК делать шаг назад (в
направлении от 3′- к 5′- концу) и вырезать
последний нуклеотид, если он некомплементарен
нуклеотиду в матричной цепи ДНК. Этот
процесс исправления ошибок спаривания
(или коррекция) иногда не срабатывает,
и тогда в ДНК по окончании репликации
остаются некомплементарные пары, тем
более, что ДНК-полимераза а лишена
корректирующего механизма и «ошибается»
чаще, чем другие полимеразы.

При
неправильном спаривании в первичной
структуре дочерней цепи ДНК необычные
основания не появляются, нарушена только
комплементарность. Система репарации
некомплементарных пар должна происходить
только на дочерней цепи и производить
замену некомплементарных оснований
только в ней. Ферменты, участвующие в
удалении неправильной пары нуклеотидов,
распознают матричную цепь по наличию
метилированных остатков аденина в
последовательностях -GATC-. Пока
основания нуклеотидных остатков в
дочерней цепи неметилированы, ферменты
должны успеть выявить ошибку репликации
и устранить её.

Распознавание
и удаление (первый этап) некомплементарного
нуклеотида происходят при участии
специальных белков mut
S, mut L, mut H.
Каждый из белков выполняет свою
специфическую функцию. Mut S находит
неправильную пару и связывается с этим
фрагментом. Mut Н присоединяется к
метилированному (по аденину) участку
-GATC-, расположенному вблизи некомплементарной
пары. Связующим между mut S и mut Н служит
белок mut L, его присоединение завершает
образование активного фермента.
Формирование комплекса mut S, mut L, mut Н на
участке, содержащем ошибку, способствует
проявлению у белка mut Н эндонуклеазной
активности. Ферментативный комплекс
гидролизует фосфоэфирную связь в
неметилированной цепи .

К
свободным концам цепи присоединяется
экзонуклеаза (второй этап). Отщепляя по
одному нуклеотиду в направлении от 3′-
к 5′- концу дочерней цепи, она устраняет
участок, содержащий некомплементарную
пару. Брешь застраивает ДНК-полимераза
β (третий этап), соединение основного и
вновь синтезированного участков цепи
катализирует фермент ДНК-лигаза
(четвёртый этап). Для успешного
функционирования экзонуклеазы,
ДНК-полимеразы р и ДНК-лигазы необходимо
участие в репарации хеликазы и SSB-белков.

Депуринизация
(апуринизация)

ДНК
каждой клетки человека теряет за сутки
около 5000 пуриновых остатков вследствие
разрыва N-гликозидной связи между пурином
и дезоксирибозой .

Тогда
в молекуле ДНК на месте этих оснований
образуется участок, лишённый азотистых
оснований, названный АП-сайтом (AP-site,
или апуриновый сайт). Термин «АП-сайт»
используют также в тех случаях, когда
из ДНК выпадают пиримидиновые основания
и образуются апиримидиновые сайты (от
англ, apurinic-apyrimidinic
site).

Этот
тип повреждений устраняет
фермент ДНК-инсертаза (от
англ, insert —
вставлять), который может присоединять
к дезоксирибозе основание в соответствии
с правилом комплементарности. В этом
случае нет необходимости разрезать
цепь ДНК, вырезать неправильный нуклеотид
и репарировать разрыв.

Дезаминирование

Реакции
дезаминирования цитозина и превращение
его в урацил , аденина в гипоксантин,
гуанина в ксантин происходят значительно
реже, чем депуринизация, и составляют
10 реакций на один геном в сутки.

Исправление
этого вида спонтанного повреждения
происходит в 5 этапов (рис. 4-24). В репарации
принимает участие ДНК-N-гликозилаза, гидролизующая
связи между аномальным основанием и
дезоксирибозой (первый этап), в результате
образуется АП-сайт, который распознаёт
фермент АП-эндонуклеаза (второй
этап). Как только в цепи ДНК возникает
разрыв, в работу вступает ещё один
фермент — АП-экзонуклеаза, который
отщепляет от цепи дезоксирибозу, лишённую
основания (третий этап). В цепи ДНК
появляется брешь размером в один
нуклеотид. Следующий фермент ДНК-полимераза
b
к З’-концу разорванной цепи присоединяет
нуклеотид по принципу комплементарности
(четвёртый этап). Чтобы соединить два
свободных конца (3′-конец встроенного
нуклеотида и 5′-конец основной цепи),
требуется ещё один фермент — ДНК-лигаза
(пятый этап).

Нерепарируемо
и поэтому опасно дезаминирование
метилированного цитозина. Продукт его
спонтанного дезаминирования — тимин,

Б.
Индуцируемые повреждения

Индуцируемые
повреждения возникают в ДНК в результате
воздействия разнообразных мутагенных
факторов как радиационной, так и
химической природы.

Образование
димеров пиримидиновых оснований

Под
действием УФО двойная связь между С₅ и
С₆ атомами
углерода в составе пиримидиновых
оснований (тимине и цитозине) может
разрываться. Атомы углерода остаются
связанными одной связью. Расстояние
между параллельными плоскостями
оснований полинуклеотидной цепи, в
которых произошёл разрыв., равно примерно
3,4 .
Это расстояние позволяет освободившимся
валентностям между С-С атомами
пиримидиновых оснований, расположенных
последовательно в цепи ДНК, сформировать
циклобутановое кольцо . В зависимости
от того, какие основания соединены в
димер, их называют димерами тимина,
цитозина или тимин-цитозиновыми димерами.

Удаление
пиримидиновых димеров происходит под
действием фотолиазы Фермент
расщепляет вновь образовавшиеся связи
между соседними пиримидиновыми
основаниями и восстанавливает нативную
структуру. В фотолиазе есть участок,
либо сам поглощающий фотоны (в синей
части спектра), либо связывающийся с
кофакторами, адсорбирующими свет. Таким
образом, свет активирует фотолиазу,
которая распознаёт димеры в облучённой
ДНК, присоединяется к ним и разрывает
возникшие между пиримидиновыми кольцами
связи. После этого фермент отделяется
от ДНК.

Повреждения
оснований ДНК химическими мутагенами

Азотистые
основания в ДНК могут подвергаться
разнообразным повреждениям: алкилированию,
окислению, восстановлению или связыванию
основания с формамидными группировками.
Репарация начинается с присоединения
ДНК-N-гликозилазы к повреждённому
основанию. Существует множество
ДНК-М-гликозилаз, специфичных к разным
модифицированным основаниям. Ферменты
гидролитически расщепляют N-гликозидную
связь между изменённым основанием и
дезоксирибозой, это приводит к образованию
АП-сайта в цепи ДНК (первый этап). Репарация
АП-сайта может происходить или только
при участии ДНК-инсертазы, которая
присоединяет к дезоксирибозе основание
в соответствии с правилом комплементарности,
или при участии всего комплекса ферментов,
участвующих в репарации: АП-эндонуклеазы,
АП-экзонуклеазы, ДНК-полимеразы β и
ДНК-лигазы.

В.
Дефекты репарационных систем и
наследственные болезни

Репарация
необходима для сохранения нативной
структуры генетического материала на
протяжении всей жизни организма. Снижение
активности ферментов репарационных
систем приводит к накоплению повреждений
(мутаций) в ДНК.

Причиной
многих наследственных болезней человека
выступает нарушение отдельных этапов
процесса репарации.

Пигментная
ксеродерма

У
больных в системе репарации снижена
активность ферментов, ответственных
за удаление неправильных оснований,
«застройку» бреши и другие функции.
Дефект репарационной системы проявляется
в сверхчувствительности к УФ-свету, что
приводит к появлению красных пятен на
коже, переходящих в незаживающие коросты
и нередко в рак кожи.

Трихотиодистрофия

Заболевание
связано с повышенной фоточувствительностью
ДНК, вызванной снижением активности
фермента, участвующего в удалении
димеров тимина. Симптомы заболевания:
ломкость волос вследствие нехватки
серы в белках волос и их луковиц; часто
умственная д физическая отсталость;
аномалии кожи и зубов.

Соседние файлы в предмете Биохимия

#
#
#
#
#
#
#
#
#
09.02.2016709.57 Кб59бх.pdf
#
#

Источник

Механизмы исправления ошибок во время репликации ДНК и ее репарация вследствие повреждений на протяжении всего жизненного цикла клетки.

Основные моменты:

Клетки имеют различные механизмы предотвращения возникновения мутаций – необратимых изменений в ДНК
В процессе синтеза ДНК, большинство ДНК-полимераз «проверяют свою работу» и проводят замену бо́льшей части ошибочно вставленных нуклеотидов. Этот процесс можно назвать исправлением ошибок.
Сразу после синтеза ДНК любые оставшиеся ошибочные нуклеотиды обнаруживаются и заменяются в так называемом процессе репарации ошибочно спаренных нуклеотидов.
Если ДНК повреждена, она может быть восстановлена с помощью различных механизмов, например, путём прямой репарации, эксцизионной репарации или путём восстановления двухцепочечных разрывов
- пострепликативной репарации.

Введение

Как ДНК связана с раком? Рак возникает при неконтролируемом делении клеток, когда игнорируются клеточные «стоп»-сигналы, что приводит к образованию опухоли. Это неправильное поведение клеток вызвано накопившимися мутациями — необратимыми изменениями последовательности ДНК клетки.

На самом деле, ошибки в процессе репликации и повреждения ДНК возникают в клетках нашего тела постоянно. Однако в большинстве случаев они не приводят к раку и даже не вызывают мутаций, такие ошибки обычно обнаруживаются и исправляются в процессе репарации ДНК. Если же повреждение исправить не удаётся, то в клетке включается механизм самоуничтожения — (апоптоз), который предотвращает передачу поврежденной ДНК дочерним клеткам.

Мутации возникают и передаются дочерним клеткам только тогда, когда эти механизмы не справляются. В частности, рак возникает в случае накопившихся в одной клетке мутаций генов, связанных с делением.

В этой статье мы подробно рассмотрим механизмы, используемые клетками для исправления ошибок, которые возникают в процессе репликации. К ним относятся:

Исправление ошибок – процесс, который возникает во время репликации ДНК.
Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов, которая происходит сразу же после репликации ДНК.
Механизмы репарации, которые выявляют и исправляют повреждения ДНК на протяжении всего клеточного цикла

Исправление ошибок

ДНК-полимеразы — это ферменты, участвующие в репликации ДНК. Во время копирования ДНК большинство ДНК-полимераз «проверяют», корректный ли нуклеотид они добавляют. Этот процесс называется исправлением ошибок. Если полимераза обнаружит, что был добавлен неправильный нуклеотид, она сразу же удалит и заменит его и только после этого продолжит синтез ДНКstart superscript, 1, end superscript.

Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов

Процесс исправления избавляет от основной массы ошибок, но не от всех. После создания новой ДНК запускается механизм репарации ошибочно спаренных нуклеотидов — удаления и замены ошибочно спаренных нуклеотидов, оставшихся в результате репликации. Исправление несоответствий между парами оснований также может включать в себя исправление небольших вставок и делеций, возникающих вследствие «соскальзывания» полимеразы с исходной цепи squared.

Как происходит восстановление неправильно спаренных нуклеотидов? Во-первых, белковый комплекс распознаёт неправильно спаренный нуклеотид и связывается с ним. Другой комплекс разрезает ДНК в области несовпадения, а ещё одна группа ферментов отщепляет некорректный нуклеотид вместе с небольшим участком вокруг него. Затем ДНК-полимераза заполняет этот пробел правильными нуклеотидами, а фермент ДНК-лигаза сшивает разрывы в цепиsquared.

Удивительно: как белки, участвующие в восстановлении ДНК, определяют, «кто прав» во время репарации ошибочно спаренных нуклеотидов? То есть, когда два основания неправильно соединены (как G (гуанин) и T (тимин) на рисунке выше), какое из этих двух оснований должно быть удалено и заменено?

У бактерий можно отличить исходную и дочернюю цепи ДНК по метилированным основаниям. На исходной цепи ДНК есть метильные (minus, start text, C, H, end text, start subscript, 3, end subscript) группы, присоединенные к некоторым из ее оснований, а у дочерней цепи таких групп еще нетcubed.

У эукариот процессы, позволяющие идентифицировать исходную цепь при устранении несоответствий, включают распознавание одноцепочечных разрывов, которые обнаруживаются только у дочерней цепи cubed.

Механизмы репарации ДНК

С ДНК может что-нибудь случиться практически в любой момент жизни клетки, а не только во время репликации. Фактически, ДНК постоянно повреждается из-за воздействия внешних факторов: ультрафиолетового излучения и радиации, химических веществ, не говоря уже о спонтанных процессах, которые протекают даже без вмешательства окружающей среды!start superscript, 4, end superscript

К счастью, наши клетки имеют механизмы восстановления, с помощью которых они находят и исправляют большинство повреждений ДНК. Можно выделить несколько типов репарации:

Прямая репарация. Некоторые повреждения ДНК, вызванные химическими реакциями, могут быть «исправлены» находящимися в клетке ферментами.
Эксцизионная репарация. Повреждение одного или нескольких нуклеотидов ДНК часто исправляется удалением и заменой поврежденного участка. При эксцизионной репарации оснований удаляется только поврежденное основание. В случае эксцизионной репарации нуклеотидов, как и в случае репарации ошибочно спаренных нуклеотидов, которое мы рассмотрели выше, удаляются целиком нуклеотиды.
Репарация двухцепочечных разрывов: Существуют два основных способа: негомологичное соединение концов и гомологичная рекомбинация. Они используются для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (когда вся хромосома разделяется на две части).

Прямая репарация

В некоторых случаях клетка может исправить повреждение ДНК, обратив вызвавшую его реакцию. Дело в том, что «повреждение ДНК» — это, как правило, присоединение к ней лишней группы в результате химической реакции.

Например, гуанин (G) может подвергаться реакции с присоединением метильной (minus, start text, C, H, end text, start subscript, 3, end subscript) группы к атому кислорода в азотистом основании. Если это не исправить, метил-содержащий гуанин будет связываться с тимином (Т), а не с цитозином (С) во время репликации ДНК. К счастью, у людей и многих других организмов есть фермент, который может удалить метильную группу, обратив реакцию, и тем самым вернуть азотистое основание в нормальное состояниеstart superscript, 5, end superscript.

Эксцизионная репарация оснований

Эксцизионная репарация оснований — это механизм, используемый для обнаружения и удаления определенных типов поврежденных азотистых оснований. Ключевую роль в нем играет группа ферментов, называемых гликозилазами. Каждая гликозилаза обнаруживает и удаляет определенный вид поврежденных оснований.

Например, в процессе реакции дезаминирования цитозин может превратиться в урацил — основание, обычно встречающееся только в РНК. Во время репликации ДНК урацил будет соединяться с аденином, а не с гуанином (в отличие от цитозина), поэтому такое превращение может привести к возникновению мутацииstart superscript, 5, end superscript.

Для предотвращения подобных изменений гликозилаза, являющаяся частью сигнального пути эксцизионной репарации, обнаруживает и удаляет дезаминированные цитозины. После того, как основание было удалено, удаляется и оставшаяся часть нуклеотида, а другие ферменты заполняют пробелstart superscript, 6, end superscript.

Эксцизионная репарация нуклеотидов

Эксцизионная репарация нуклеотидов — это еще один способ удаления и замены поврежденных оснований. В результате нее обнаруживаются и корректируются повреждения, которые искажают форму двойной спирали ДНК. Например, азотистые основания могут измениться, присоединив к себе громоздкие группы атомов, в частности, в результате воздействия химических веществ, содержащихся в сигаретном дымеstart superscript, 7, end superscript.

Эксцизионная репарация нуклеотидов также используется для устранения повреждений, вызванных ультрафиолетовым излучением, например, при получении солнечного ожога. Под воздействием УФ-излучения цитозин и тимин могут вступать в реакцию с соседними основаниями, которые также являются цитозином или тимином, образуя при этом связи, изменяющие форму двойной спирали и вызывающие ошибки в процессе репликации ДНК. Наиболее распространенный тип таких связей — тиминовый димер — он состоит из двух тиминовых оснований, вступающих в реакцию друг с другом и образующих химическую связьstart superscript, 8, end superscript.

При эксцизионной репарации нуклеотидов поврежденные нуклеотиды удаляются вместе с соседними нуклеотидами. В этом процессе хеликаза (фермент, раскручивающий ДНК) раскрывает ДНК, образуя пузырь, а ферменты, разрезающие ДНК, отсекают поврежденную часть пузыря. Полимераза заполняет пробел, а лигаза сшивает разрыв в цепиstart superscript, 9, end superscript.

Репарация двухцепочечных разрывов

Некоторые факторы окружающей среды, например, радиация, могут вызывать разрывы обеих цепочек ДНК (разделение хромосомы на две части). Такие повреждения ДНК, если верить комиксам, ведут к появлению супергероев, но могут встречаться и после реальных катастроф, например, Чернобыльской.

Двухцепочечные разрывы опасны, потому что большие сегменты хромосом и сотни содержащихся в них генов могут быть потеряны, если разрыв не будет восстановлен. Существует два способа восстановления двухцепочечных разрывов ДНК: негомологичное соединение концов и гомологичная рекомбинация.

При негомологичном соединении концов два разорванных конца хромосомы просто склеиваются обратно. Этот механизм восстановления является «грубым» и неточным, в результате в месте разрыва, как правило, либо теряются нуклеотиды, либо добавляются лишние, что может привести к мутациям. Но это в любом случае лучше потери целого фрагмента хромосомыstart superscript, 10, end superscript.

При гомологичной рекомбинации для восстановления разрыва используется фрагмент из гомологичной хромосомы, который соответствует поврежденной хромосоме (или из сестринской хроматиды, если ДНК была реплицирована). В этом процессе две хромосомы объединяются, и неповрежденная область гомологичной хромосомы или хроматиды используется в качестве матрицы для замены поврежденной области. Гомологичная рекомбинация работает «чище», точнее, чем негомологичное соединение концов, и обычно не приводит к образованию мутацийstart superscript, 11, end superscript.

Репарация ДНК и заболевания человека

Доказательства важности механизмов репарации получены на основе генетических заболеваний человека. Во многих случаях мутации в генах, которые кодируют белки, участвующие в репарации, связаны с наследственным раком. Например:

Наследственный неполипозный колоректальный рак (также называемый синдромом Линча) вызван мутациями в генах, кодирующих белки, которые участвуют в репарации ошибочно спаренных нуклеотидовstart superscript, 12, comma, 13, end superscript. Поскольку такие нуклеотиды не восстанавливаются, у людей, страдающих этим синдромом, мутации накапливаются гораздо быстрее, чем у здоровых. Это может привести к развитию опухолей толстой кишки.
Люди с пигментной ксеродермой очень чувствительны к ультрафиолетовому излучению. Это вызвано мутациями в белках, участвующих в эксцизионной репарации нуклеотидов. Когда они не функционируют, димеры тимина и другие виды повреждений, вызванные ультрафиолетовым излучением, перестают восстанавливаться. У людей с пигментной ксеродермой после нескольких минут пребывания на солнце могут возникнуть сильные солнечные ожоги, и около половины из них заболевают раком кожи в возрасте до 10 лет, если только они не избегают солнечных лучейstart superscript, 14, end superscript.

Источник

РЕПАРАЦИЯ ДНК

Системы репарации

1 Прямая репарация. Примеры

2 Эксцизионная репарация. Примеры и виды

3 Репарация ошибок репликации ДНК

4 Рекомбинантная (пострепликативная) репарация у бактерий

5 SOS-репарация

Системы репарации ДНК достаточно консервативны в эволюции от бактерий до человека и наиболее изучены у Е. coli.

Известны два типа репарации: прямая и эксцизионная (от англ. excision — вырезание).

Рекомендуемые материалы

Прямая репарация

Прямая репарация — наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.

О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза

1. Так действует, например, О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза

( фермент – самоубийца), которая снимает метильную группу с азотистого основания на один из собственных остатков цистеина

У Е. coli может в 1 мин синтезироваться до 100 молекул этого белка. Аналогичный по функциям белок высших эукариот, очевидно, играет важную роль в защите от рака, вызываемого внутренними и внешними алкилирующими факторами.

ДНК-инсертаза

2. АР-сайты могут репарироваться путем прямой вставки пуринов при участии ферментов, называемых ДНК-инсертазами (от англ. insert- вставлять).

фотолиаза

3. Тиминовые димеры «расшиваются» путем прямой репарацци при участии фотолиаз, осуществляющих соответствующее фотохимическое превращение. ДНК-фотолиазы представляют собой группу ферментов, активируемых светом, с длиной волны 300 — 600 нм (видимая область), для чего в их структуре имеется особый светочувствительный центр.

Они широко распространены в природе и обнаружены у бактерий, дрожжей, насекомых, рептилий, земноводных и человека. Эти ферменты нуждаются в разнообразных кофакторах (FADH, тетрагидрофолиевая кислота и др.), участвующих в фотохимической активации фермента. Фотолиаза Е. coli представляет собой белок с молекулярной массой 35 кДа, прочно связанный с олигорибонуклеотидом длиной 10-15 нуклеотидов, необходимым для активности фермента.

Примеры прямой репарации

1. Метилированное основание O6-mG диметилируется ферментом метилтрансфераза О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза ( фермент – самоубийца), которая переносит метильную группу на один из своих остатков

цистеина

СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – метилированное основание O6-mG демитилируется ферментом метилтрансферазой, который переносит метильную группу на один из своих остатков аминокислоты цистеина.

3. Фотолиаза присоединяется к тиминовому димеру и после облучения этого комплекса видимым светом (300-600 нм) димер расшивается

СХЕМА ПРИМЕРА ПРЯМОЙ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ В ДНК – Фотолиаза

присоединяется к тиминовому димеру и после облучения видимым спектром света этот димер расшивается

Эксцизионная репарация

(от англ. excision — вырезание).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Эксцизионная репарация включает удаление поврежденных азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы.

МЕХАНИЗМ

В эксцизионной репарации обычно принимают участие несколько ферментов, а сам процесс затрагивает

не только поврежденный,

но и соседние с ним нуклеотиды.

УСЛОВИЯ

Для эксцизионной репарации необходима вторая (комплементарная) цепь ДНК. Общая упрощенная схема эксцизионной репарации представлена на рис. 171.

ЭТАПЫ

Первым этапом эксцизионной репарации является вырезание аномальных азотистых оснований. Его катализируют группа ДНК-N-гликозилаз — ферменты, расщепляющие гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием.

ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:

У человека ДНК-N-гликозилазы обладают высокой субстратной специфичностью: разные ферменты этого семейства распознают и вырезают различные аномальные основания (8-оксогуанин, урацил, метилпурины и др.).

У бактерий ДНК-N-гликозилазы такой субстратной специфичностью не обладает

ОБЩИЕ ФЕРМЕНТЫ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ

НАЗВАНИЕ	ФУНКЦИЯ	МЕХАНИЗМ
ДНК-N-гликозилазы	вырезание аномальных азотистых оснований	расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием
АР-эндонуклеаза	создает условия для работы следующего фермента — экзонуклеазы	разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте
экзонуклеаза	выщепляет несколько нуклеотидов	последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК

КОНКРЕТНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНЫЕ ШАГИ ЭТОГО МЕХАНИЗА :

В результате действия ДНК-N-гликозилаз образуется АР-сайт, который атакуется ферментом АР-эндонуклеазой. Она разрывает сахаро-фосфатный остов молекулы ДНК в АР-сайте и тем самым создает условия для работы следующего фермента — экзонуклеазы, которая последовательно отщепляет несколько нуклеотидов от поврежденного участка одной цепи ДНК.

ЧТО ПРОИСХОДИТ ДАЛЕЕ:

В клетках бактерий освобожденное место заполняется соответствующими нуклеотидами при участии ДНК-полимеразы I, ориентирующейся на вторую (комплементарную) цепь ДНК.

Поскольку ДНК-полимераза I способна удлинять З’-конец одной из цепей в месте разрыва в двуцепочечной ДНК и удалять нуклеотиды с 5′-конца того же разрыва,

т.е. осуществлять “ник-трансляцию” , этот фермент играет ключевую роль в репарации ДНК. Окончательное сшивание репарированных участков осуществляет ДНК-лигаза.

В клетках эукариот (млекопитающих)

Эксцизионная репарация ДНК в клетках млекопитающих сопровождается резким всплеском активности еще одного фермента – поли АDР-рибозо-полимеразы. При этом происходит ADP-рибозилирование белков хроматина (гистонов и негистоновых белков), что ведет к ослаблению их связи с ДНК и открывает доступ ферментам репарации.

Донором ADP-рибозы в этих реакциях выступает NAD+, запасы которого сильно истощаются при эксцизионной репарации повреждений, вызываемых рентгеновским облучением:

Отрицательно заряженные остатки ADP-рибозы из внутреннего состава молекулы NAD+ присоединяются через радикал глутаминовой кислоты или фосфосерина к белкам хроматина, что ведет к нейтрализации положительных зарядов этих белков и ослаблению их контакта с ДНК.

ЧТО ПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙ ГРУППА ФЕРМЕНТОВ

ДНК – гликозилазы

расщепляет гликозидную связь между дезоксирибозой и азотистым основанием

что приводит к вырезанию аномальных азотистых оснований

ДНК — гликозилазы, участвующие в устранении окислительных повреждений ДНК в клетках прокариот и эукариот, весьма разнообразны и отличаются по субстратной специфичности, пространственной структуре и способам взаимодействия с ДНК.

К наиболее изученным ДНК-гликозилазам относятся:

эндонуклеаза III (EndoIII),

форм амидо пиримидин-ДНК-гликозилаза (Fpg),

Mut T и

Mut Y кишечной палочки.

Эндонуклеаза III Е. coli «узнает» и специфически выщепляет из ДНК окисленные пиримидиновые основания.

Этот фермент представляет собой мономерный глобулярный белок, состоящий из 211 аминокислотных остатков (мол. масса 23,4 кДа). Ген, кодирующий Endo III, секвенирован, установлена его нуклеотидная последовательность. Endo III представляет собой железосерный белок [(4Fe-4S)2+-белок], обладающий элементом надвторичной структуры типа «греческий ключ» (спираль — шпилька — спираль), служащим для связывания с ДНК. Ферменты с аналогичной субстратной специфичностью и сходной аминокислотной последовательностью выделены также из клеток быка и человека.

Форм амидо пиридин-ДНК-гликозилаза Е. coli «узнает» и выщепляет из ДНК окисленные гетероциклические основания пуринового ряда.

СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ СТАДИЯ 1

ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание

АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК

СХЕМА ЭКЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ

1 ДНК N гликозидаза удаляет поврежденное основание

АР эндонуклеаза вносит разрыв в ДНК

2 Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов

3 ДНК полимераза заполняет освободившийся участок комплементарными

Мононуклеотидами

ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК

Mut T — небольшой белок с молекулярной массой 15 кДа, обладающий нуклеозидтрифосфатазной активностью, который преимущественно гидролизует dGTP до dGMP и пирофосфата.

Биологическая роль Mut T заключается в предотвращении образования во время репликации неканонических пар А:G и А: 8-oxo-G.

Такие пары могут появляться в том случае, когда окисленная форма

dGTP (8-oxo-dGTP) становится субстратом ДНК-полимеразы.

Mut T гидролизует 8-oxo-dGTP в 10 раз быстрее, чем dGTP.

Это делает 8-oxo-dGTP наиболее предпочтительным субстратом Mut T и объясняет его функциональную роль.

Mut Y представляет собой специфическую аденин-ДНК-гликозилазу, расщепляющую N-гликозидную связь между аденином и дезоксирибозой аденозина, образующего неканоническую пару с гуанином.

Функциональная роль этого фермента заключается в предотвращении мутации

T:A — G:A путем отщепления неповрежденного остатка аденина из пары оснований A: 8-oxo-G.

Нуклеотидная эксцизионная репарация

(АТФ-зависимый механизм удаления повреждений из ДНК)

В последнее время в эксцизионной репарации особое внимание уделяют АТР-зависимому механизму удаления повреждений из ДНК. Этот вид эксцизионной репарации получил название нуклеотидная эксцизионная репарация (nucleotide excision repair; NER).

Она включает в себя ДВА ЭТАПА:

1. удаление из ДНК олигонуклеотидных фрагментов, содержащих повреждение, и

Эксинуклеаза – фермент, удаляющий фрагменты ДНК

2. последующую реконструкцию цепи ДНК с участием комплекса ферментов (нуклеаз, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы и др.).

Удаление фрагмента ДНК происходит по обе стороны поврежденного нуклеотида. Длина удаляемых олигонуклеотидных фрагментов отличается у прокариот и эукариот.

Удаление фрагмента ДНК у прокариот

Так, у Е. coli, В. subtilus, Micrococcus luteus вырезается фрагмент длиной 12-13 нуклеотидов,

Удаление фрагмента ДНК у эукариот

а у дрожжей, земноводных и человека — фрагмент, состоящий из 24-32 нуклеотидов.

Эксинуклеаза – фермент, удаляющий фрагменты ДНК

Выщепление фрагмента ДНК осуществляется ферментом эксинуклеазой (excinuclease). У Е. coli этот фермент состоит из 3 различных протомеров –

uvrA

uvr В

uvr С

каждый из которых выполняет определенную функцию в ходе эксцизионного выщепления фрагмента ДНК. Название этих белков дано по первым буквам слов «ultra violet repair».

Протомер uvr А обладает АТРазной активностью, связывается с ДНК в виде димера, осуществляя

первичное распознавание повреждения и

связывание uvr В

Протомер uvr В обладает:

1 . Латентной АТР-азной и латентной хеликазной активностью, необходимой для изменения конформаций и расплетания двойной спирали ДНК;

2. Эндонуклеазной активностью, расщепляя межнуклеотидную (фосфодиэфирную) связь со стороны З’-конца выщепляемого фрагмента.

Протомер uvr С действует как эндонуклеаза, вносящая разрыв в репарируемую цепь ДНК с 5′-конца вырезаемого фрагмента.

Таким образом, протомеры uvr A, uvr В, uvr С взаимодействуют с ДНК в определенной последовательности, осуществляя АТР-зависимую реакцию выщепления олигонуклеотидного фрагмента из репарируемой цепи ДНК.

Образовавшаяся брешь в молекуле ДНК реставрируется при участии ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы. Модель эксцизионной репарации с участием вышеперечисленных ферментов представлена на рис. 172.

Эксцизионные репарации у человека

Эксцизионные репарации у человека также имеют АТФ — зависимый характер и включают три основных этапа:

узнавание повреждения,

двойное разрезание цепи ДНК,

восстановительный синтез и

лигирование репарируемой цепи.

Однако, в эксцизионной репарации ДНК человека принимают участие

25 различных полипептидов,

16 из которых участвуют в выщеплении олигонуклеотидного фрагмента, являясь протомерами эксинуклеазы,

а остальные 9 осуществляют синтез репарируемого участка молекулы.

В репарационной системе ДНК у человека весьма существенную роль выполняют белки транскрипции –

РНК-полимераза II и

TF ПН — один из шести основных факторов транскрипции эукариот.

Следует отметить, что эксцизионная репарация у прокариот, как и у эукариот, зависит от функционального состояния ДНК:

транскрибируемая ДНК репарируется быстрее,

чем транскрипционно неактивная.

Этот феномен объясняется следующими факторами:

структурой хроматина,

гомологией цепей транскрибируемых участков ДНК,

эффектом повреждения цепей и его влиянием на РНК-полимеразу.

ВАЖНОЕ ЗАМЕЧАНИЕ:

КОДИРУЮШАЯ ЦЕПЬ ДНК (цепь хранения информации)

МАТРИЧНАЯ ЦЕПЬ ДНК (с неё происходит списывание информации)

Известно, что такие крупные повреждения, как образование тиминовых димеров, блокируют транскрипцию как у бактерий, так и у человека, если они происходят на матричной цепи ДНК (повреждения на кодирующей цепи не влияют на транскрипционный комплекс). РНК-полимераза останавливается в месте повреждения ДНК и блокирует работу транскрипционного комплекса.

Транскрипционно-репарационный фактор сцепления (TRCF).

У Е. coli усиление репарации при транскрипции опосредуется одним специальным белком — транскрипционно-репарационным фактором сцепления (TRCF).

Этот белок способствует :

1. отсоединению РНК-полимеразы от ДНК

2. одновременно стимулирует образование комплекса белков,

осуществляющих репарацию поврежденного участка.

По окончании репарации РНК-полимераза встает на место и транскрипция продолжается (см. рис.).

Итак общая схема эксцизионной репарации

1. ДНК-N-гликозилаза удаляет поврежденное основание

2. АР –эндонуклеаза вносит разрыв в цепь ДНК

3. Экзонуклеаза удаляет ряд нуклеотидов

4. ДНК-полимераза заполняет освободившийся участок

комплементарными нуклеотидами

5. ДНК лигаза сшивает репарированную цепь ДНК

Репарация ошибок репликации ДНК

путем метилирования

Ошибки спаривания азотистых оснований во время репликации ДНК происходят достаточно часто (у бактерий один раз на 10 тыс. нуклеотидов), в результате которых в дочернюю цепь ДНК включаются некомплементарные нуклеотидам материнской цепи нуклеотиды — мисмэтчи (англ. mismatch не соответствовать).

Несмотря на то, что ДНК-полимераза I прокариот обладает способностью к самокоррекции, ее усилия по устранению ошибочно присоединенных нуклеотидов иногда оказываются недостаточны, и тогда в ДНК остаются некоторые неправильные (некомплементарные) пары.

В этом случае репарация происходит с использованием определенной системы, связанной с метилированием ДНК. Действие этой системы репарации основано на том, что после репликации через определенное время (несколько минут) ДНК подвергается метилированию.

У Е. coli метилируется в основном аденин с образованием

N6-мeтил-аденина (N6-mA).

До этого момента вновь синтезированная (дочерняя) цепь остается неметилированной.

Если в такой цепи есть неспаренные нуклеотиды, то она подвергается репарации: Таким образом метилирование метит ДНК и

включает систему исправления ошибок репликации.

В этой системе репарации узнаются особые структуры:

последовательность G-N6-mA-T-С и следующая за ней деформация

в двойной спирали в месте отсутствия комплементарности (рис. ниже).

В устранении неспаренных нуклеотидов в полуметилированной молекуле ДНК принимает участие достаточно сложный комплекс ферментов репарации, который сканирует поверхность молекулы ДНК, вырезает участок дочерней цепи, прибегающей к мисмэтчам, а затем создает условия для застраивания

его нужными (комплементарными) нуклеотидами.

Различные компоненты этого комплекса обладают разными активностями нуклеазной,

хеликазной,

АТРазной,

необходимыми для внесения разрывов в ДНК и выщепления нуклеотидов, расплетания двойной спирали ДНК и энергетического обеспечения движения комплекса вдоль репарируемой части молекулы.

Сходный по структуре и функциям комплекс ферментов репарации выявлен и у человека.

Рекомбинантная (пострепликативная) репарация

В тех случаях, когда по тем или иным причинам вышерассмотренные системы репарации оказываются нарушенными, в цепях ДНК могут образовываться бреши (недорепарированные участки), имеющие иногда весьма существенные размеры, что чревато нарушением системы репликации и может привести к гибели клеток.

В этом случае клетка в состоянии использовать для репарации одной молекулы ДНК другую полученную после репликации молекулу ДНК, т. е. привлечь для этой цели механизм рекомбинации.

У бактерий

У бактерий в рекомбинантной репарации принимает участие белок Rec А. Он связывается с одноцепочечным участком ДНК и вовлекает его в рекомбинацию с гомологичными участками неповрежденных цепей другой молекулы ДНК.

В результате и разорванная (содержащая бреши), и неповрежденная цепи репарируемой молекулы ДНК оказываются спаренными с неповрежденными комплементарными участками ДНК, что открывает возможность репарации путем вышеохарактеризованных систем.

При этом могут происходить вырезание определенного фрагмента и

заполнение с его помощью бреши в дефектной цепи.

Возникающие при этом пробелы и разрывы в цепях ДНК восполняются с участием ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы.

SOS-репарация

Существование этой системы впервые постулировал М. Радман в 1974 г. Он же дал название этому механизму, включив в него международный сигнал бедствия «SOS» (спасите наши души).

И действительно, эта система включается тогда, когда повреждений в ДНК становится настолько много, что угрожает жизни клетки. В этом случае происходит индукция активности разнообразной группы генов, задействованных в различных клеточных процессах, сопряженных с репарацией ДНК.

Включение тех или иных генов, определяемых количеством повреждений в ДНК, приводит к разным по значимости клеточным ответам (начиная со стандартной репарации поврежденных нуклеотидов и кончая подавлением клеточного деления).

Наиболее изучена SOS-репарация у Е. coli, главными участниками которой являются белки, кодируемые генами Rec A и Lex А.

Первый из них представляет собой полифункциональный белок Rec A, участвующий

в рекомбинации ДНК, а также

в регуляции транскрипции генов фага лямбда, поражающего Е. coli,

а второй (белок Lex А) является репрессором транскрипции большой группы генов, предназначенных для репарации ДНК бактерий. При его ингибировании или разрешении репарация активируется.

Связывание Rec А с Lex А приводит к расщеплению последнего и соответственно к активации генов репарации.

В свою очередь, индукция SOS-системы бактерии служит для фага лямбда сигналом опасности и приводит к тому, что профаг переключается с пассивного на активный (литический) путь существования, вызывая тем самым гибель клетки-хозяина.

SOS-система репарации выявлена не только у бактерий, но и у животных, и человека.

Гены, задействованные в SOS-репарации повреждений ДНК

Гены	Последствия активации гена
uvr А, В, С, D	Репарация повреждений вторичной структуры ДНК
Rec А	Пострепликативная репарация, индукции SOS-системы
lex А	Выключение SOS-системы
rec N, ruv	Репарация двунитевых разрывов
ssb	Обеспечение рекомбинационной репарации
umu С, D	Мутагенез, вызванный изменениями свойств ДНК-полимеразы
sul А	Подавление клеточного деления

Заключение

Исправление повреждений в ДНК тесным образом связано с другими фундаментальными молекулярно-генетическими процессами: репликацией, транскрипцией и рекомбинацией. Все эти процессы оказываются переплетенными в общую систему взаимодействий, обслуживаемую большим числом разнообразных белков, многие из которых являются полифункциональными молекулами, задействованными в контроле реализации генетической информации в клетках про- и эукариот. В то же время очевидно, что природа «не скупится» на элементах контроля, создавая сложнейшие системы коррекции тех повреждений в ДНК, которые несут опасность для организма и особенно для его потомства. С другой стороны, в тех случаях, когда репарационных возможностей недостаточно для сохранения генетического статуса организма, наступает необходимость в программируемой клеточной смерти – апоптозе..

МАТЕРИАЛ И ПРИВЕДЕННЫЕ ДАЛЕЕ СХЕМЫ ВЗЯТЫ ИЗ РУКОВОДСТВА Кирпичев А.С., Севастьянова Г.А. Молекулярная биология М. AKADEMA. 2005 395 C.

СХЕМА НУКЛЕОТИДНОЙ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ У E.COLI С УЧАСТИЕМ ЭКСИНУКЛЕАЗЫ

1. ТРАНСКРИПЦИОННО НЕЗАВИСИМЫЙ МЕХАНИЗМ