Ошибки при проведении ифа

Характеристика наиболее часто встречающихся причин аналитических ошибок при проведении рид и ифа

Таким
образом, основным правилом работы
лабора­тории является проведение
внутрилабораторного контроля качества
по описанным выше критериям. Внешняя
эксперти­за лабораторных исследований
обязательна для всех лабора­торий и
не заменяет внутрилабораторного контроля
качества. Внутри лабораторный контроль
выявляет преимущественно случайные
ошибки, внешний –
систематические ошибки исследований
лаборатории. Ряд фирм, включая
отечественные, представляет компьютерные
программы по проведению кон­троля
качества лабораторных исследований.

8.
Определить воспроизводимость (В)
результатов ИФА
(записать в тетрадь оформить протокол)

10
образцов сыворотки крови поставлены в
5 повторах. При этом один слабоположительный
образец в 4 случаях дал положительный
результат, а в 1 случае –
отрицательный, и один отрицательный
образец в 3 случаях дал отрицательный
результат, а в 2 случаях –
положительный, остальные результаты
воспроизвелись все 5 раз.

Заключение: воспроизводимость (В)
тест-системы ИФА при этом
составит:…………… %

5.
Подведение итогов занятия –
5 мин

Соседние файлы в предмете [НЕСОРТИРОВАННОЕ]

• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #
• #

Иммуноферментный анализ (ИФА) — это метод выявления в крови специфических антител, представляющих собой молекулы иммуноглобулинов. Он отличается высокой точностью и чувствительностью, позволяет определить не только качественный, но и количественный состав антигенов и антител в организме. В медицине иммуноферментный анализ применяется для выявления болезней, которые провоцируют микроорганизмы различных классов — от вирусов до паразитов, а также для диагностики аутоиммунных заболеваний.

• Особенности анализа ИФА
• Показания к проведению иммуноферментного анализа крови
• Подготовка к анализу ИФА
• Интерпретация результатов анализа

Особенности анализа ИФА

Иммуноферментный анализ состоит из двух компонентов — иммунной и ферментативной реакции. Иммунная реакция связывает биологические молекулы, элементы клетки или микроорганизма, которые пытаются выявить. Ферментативная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции.

ИФА относится к непрямым методам диагностики, так как с ее помощью можно определить наличие антител к патогенному микроорганизму, а не самого возбудителя. Этот анализ рекомендуется выполнять совместно с ПЦР-диагностикой.

Важность иммуноферментного анализа несомненна: его применяют, если требуется определить стадию развития заболевания, провести мониторинг проведенного курса лечения, оценить ответ организма на лечение либо подобрать оптимальную схему терапии.

К преимуществам ИФА относят следующее:

• высокая чувствительность (до 90%), позволяющая обнаружить микроорганизмы даже в том случае, если они присутствуют в минимальных концентрациях;
• возможность выявить заболевание еще до проявления симптомов;
• скорость проведения анализа и получения результатов;
• возможность определить примерный срок заражения, а также тип течения инфекции (острая или хроническая);
• выявление с высокой степенью достоверности микроорганизмов, которые невозможно определить путем применения других диагностических методов (посева, микроскопии и т.д.).

Показания к проведению иммуноферментного анализа крови

Методика ИФА позволяет выявить в крови любой антиген — не только собственный, но и чужеродный для организма. Ее назначают при подозрении на скрытую инфекцию. Показаниями для проведения этого анализа являются:

• выявление различных инфекций (гепатиты, паразитарные инфекции, герпес, хламидии, токсоплазмоз, сальмонеллез, вирус Эпштейн-Барра);
• определение содержания гормонов для оценки работы органов эндокринной системы — щитовидной железы, гипофиза, половых желез;
• выявление и отслеживание онкомаркеров (ПСА у мужчин, фактор некроза опухоли и т.д.);
• диагностика аутоиммунных заболеваний (системный васкулит, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, синдром Шегрена).

Также иммуноферментный анализ позволяет определить наличие антител к вирусу у пациента после прививки.

ИФА не оказывает непосредственного воздействия на антиген: этот метод позволяет оценить реакцию организма на присутствие такого антигена.

Чаще всего для проведения иммуноферментного исследования используют сыворотку венозной крови, взятой у пациента натощак. Также для анализа могут использоваться околоплодные воды, спинномозговая жидкость, содержимое стекловидного тела и слизь цервикального канала и уретры.

Подготовка к анализу ИФА

Чтобы снизить риск ошибки при проведении иммуноферментного анализа, пациенту рекомендуют подготовиться к этой процедуре. Речь идет о том, чтобы в течение 7–10 дней до назначенного исследования:

• прекратить прием антибиотиков, а также противовирусных и антигистаминных препаратов;
• исключить из рациона продукты-аллергены (шоколад, мед, орехи, яйца);
• отказаться от жирных, острых, жареных блюд, алкоголя, сладостей;
• ограничить физические нагрузки;
• избегать сильных эмоциональных потрясений.

За сутки до забора крови нужно прекратить курение.

Интерпретация результатов анализа

При выполнении иммуноферментного анализа выявляют антитела разных типов – иммуноглобулины классов M, A, G (JgM, JgA, JgG). Они появляются в разные промежутки времени.

IgM указывает на то, что инфекция находится на острой стадии развития. Этот иммуноглобулин появляется в крови на 4–5 день после предполагаемого заражения. Если выявляют IgM, то пациент в данный момент является больным.

IgG характеризует хроническую форму инфекционного процесса, а также свидетельствует о наличии стойкого иммунитета к антигену. Выработка этого иммуноглобулина происходит на 20–28 день с момента заражения. IgG может сохраняться в крови долгое время – несколько месяцев и даже лет.

IgA – иммуноглобулины, выявление которых указывает на переход острой формы инфекционного процесса в хроническую. Они вырабатываются на 14–20 день с момента заражения и сохраняются в крови больного около двух месяцев.

Анализ ИФА может демонстрировать разные комбинации этих иммуноглобулинов. В зависимости от сочетания, они указывают на определенный этап в развитии заболевания:

• JgM (–), JgG (–), JgA (–). Иммунитет к инфекции отсутствует.
• JgM (–), JgG (+), JgA (–). У больного имеется иммунитет, приобретенный после введения вакцины или выполнения прививки.
• JgM (+), JgG (–/+), JgA (–/+). У пациента присутствует острая инфекция.
• JgM (+), JgG (+), JgA (+). У больного протекает период обострения хронической инфекции.
• JgM (–), JgG (+/–), JgA (+/–). У пациента имеется хроническая инфекция.
• JgM (–). Пациент был заражен, но сейчас выздоровел.

Если ИФА направлен на исследование гормонов щитовидной железы, то его допустимые границы находятся в таких пределах:

• Тиреоглобулин – до 70 МЕ/мл.
• Тироксин – 64–146 нмоль/л.
• Трийодтиронин – 1,8–2,8 нмоль/л.
• Свободный тироксин – 11–25 пмоль/л.
• Свободный трийодтиронин – 4,49–9,3 пмоль/л.

При диагностике аутоиммунных заболеваний у пациента могут выявляться такие антитела:

• Антинуклеарные (аутоантитела к антигенам ядра клеток). Они характерны для системных аутоиммунных заболеваний.
• Антитела к растворимым нуклеарным антигенам. Такие компоненты проявляются при различных системных аутоиммунных процессах.
• Антикардиолипиновые антитела IgG и IgM. Они характерны для антифосфолипидного синдрома.
• Антитела к двухспиральной ДНК, которые являются специфичными для системной красной волчанки.
• Ревматоидный фактор. Антитела такого типа выявляют при ревматоидном артрите, хотя они не специфичны конкретно для этого заболевания и могут обнаруживаться при других отклонениях, а также у абсолютно здоровых пациентов.

Сейчас ИФА-анализ широко используется для выявления антител к коронавирусной инфекции.

2001

Институт средств медицинской диагностики

ЗАО «Вектор-Бест»

А.В. Масяго

НЕКОТОРЫЕ ОШИБКИ

ПРИ ПОСТАНОВКЕ ИФА

Информационно-методическое пособие

©

ББК

Т

Некоторые ошибки при постановке ИФА. – Новоси-

Т бирск, 2001. – 132 с.

ББК

3

Многолетний опыт работы ЗАО «Вектор-Бест» по произ-

водству иммуноферментных тест-систем, постоянный кон-

такт с широким кругом потребителей продукции, как из хорошо

оснащенных диагностических центров, так и из лабораторий,

имеющих минимально необходимое для постановки иммунофер-

ментного анализа (ИФА) оборудование, дает нам возможность

классифицировать и вскрыть причины некоторых ошибок, допус-

каемых при проведении иммуноферментного анализа. Автор не

претендует на полноту освещения проблемы, однако надеется,

что эта брошюра может быть полезна для наших читателей,

использующих в своей работе ИФА.

Сотрудники ЗАО «Вектор-Бест» будут благодарны всем за

любые замечания, предложения и описания случаев из личной

практики, которые обязательно будут учтены при подготовке

нового, более полного издания.

4

1. Помещение

Требования к помещениям изложены в ведомственных инс-

трукциях. В реальной жизни руководителям достаточно трудно

выполнить все предписания, поэтому зачастую для проведения

ИФА используются приспособленные в той или иной степени по-

мещения. Далее приведены некоторые факторы, которые могут

повлиять на результат анализа.

Температура воздуха в лаборатории

Во многих тест-системах при проведении анализа по инструк-

ции рекомендуется вести инкубацию планшетов при комнатной

температуре. Под этим подразумевается температура 18–25°С. На

практике температура в помещениях лабораторий варьирует от 12

до 30°С, что может привести к неправильным результатам тести-

рования. В некоторых лабораториях пытались уменьшить влия-

ние температуры воздуха на результат реакции с помощью изме-

нения времени инкубации, однако общих формул оценки влияния

соотношения температуры и времени инкубации на оптическую

плотность не существует. Поэтому единственным способом избе-

жать этой ошибки является установка планшетов при выполне-

нии этой операции в настроенный на комнатную температуру

термостат (если температура ниже комнатной), либо прекращение

работы (если температура выше).

Обычно в состав тест-системы входят концентраты растворов,

которые перед постановкой необходимо развести дистиллирован-

ной водой. В инструкциях по применению часто не указывается,

но подразумевается, что дистиллированная вода имеет комнатную

температуру. При использовании слишком холодной дистилли-

рованной воды, особенно в растворах, предназначенных для раз-

ведения сывороток и конъюгата, можно получить неправильный

результат, независимо от температуры, при которой будет прово-

диться инкубация. Вероятность получения неправильного резуль-

тата в этом случае выше, если продолжительность инкубации мала

(например, 30 мин).

5

Относительная влажность воздуха

Как правило, влияние этого фактора менее существенно. Од-

нако, если используются длительные времена инкубации при ком-

натной температуре, то при сухом воздухе (обычно относительная

влажность воздуха в помещениях ниже в зимний период) лучше

использовать влажную камеру. В противном случае происходит

подсыхание раствора с образованием «ободка» на боковой поверх-

ности лунки планшета, который при промывке может сохраниться

и повлиять на результат анализа на следующих его стадиях. Сле-

дует заметить, что если используется настроенный на комнатную

температуру термостат при низкой температуре воздуха в лабора-

тории, то относительная влажность в термостате обычно намного

ниже относительной влажности в помещении.

Недостаточная вентиляция

Душный воздух в лаборатории приводит к быстрой утомля-

емости лаборанта, и, как следствие, к увеличению числа ошибок

(неправильный отбор проб пипеткой, занос пробы в другую лунку

и т.д.). Следует отметить, что в большинстве тест-систем в инструк-

циях указано на необходимость применения масок либо респира-

торов, что и без плохой вентиляции затрудняет дыхание.

Общая загроможденность

Для постановки анализа необходимо достаточное количество

площади лабораторного стола. В противном случае возрастает ве-

роятность пролива растворов, они могут быть перепутаны и т.п.

6

2. Оборудование и расходные материалы

Проверка автоматической пипетки

В инструкциях по применению большинства тест-систем ука-

зано, что погрешность пипеток не должна превышать 5%. Непра-

вильное дозирование растворов на любой стадии анализа может

привести как к росту, так и к снижению оптической плотности, за-

меряемой при оценке результата анализа.

Наиболее простой способ проверки пипетки – взвешивание

дистиллированной воды, дозируемой пипеткой. Вес 1 мкл дистил-

лированной воды при комнатной температуре с большой точнос-

тью равен 1 мг. Таким образом, настроив пипетку на дозу 100 мкл,

мы должны получить вес воды около 100 мг. Желательно сделать

несколько повторов для того, чтобы убедиться в воспроизводимости

результатов. Весы, позволяющие измерять вес от 10 до 200 мг с не-

обходимой точностью, достаточно доступны и просты в обращении.

Не стоит пытаться проверять точность дозирования много-

кратным повтором с последующим измерением суммарного объема

с помощью мерного цилиндра. Такой способ не позволяет обнару-

жить пипетку, которая дозирует правильный средний объем при

сильном разбросе между последовательными дозами. (Напри-

мер, пипетка настраивается на дозирование 100 мкл, произво-

дится 20 дозирований, с помощью мерного цилиндра измеряется

объем, который должен составить около 2 мл. Пипетка дозирует

случайным образом от 85 до 115 мкл, что, при большом количестве

дозирований, приводит к ожидаемому объему.)

Промыватели планшетов

Наиболее характерным источником погрешностей является

засорение каналов промывателей. Недостаточная промывка при-

водит обычно к завышению сигнала. Обнаружить это достаточно

просто – при использовании рядного промывателя повышенный сиг

нал имеет один из рядов, при использовании 96-канального – одна

и та же лунка разных планшетов. Необходимо отличать такую не-

исправность от неисправности многоканального спектрофотометра.

7

Менее часто встречается засорение пространства между иг-

лами промывателя (труднее визуально это обнаружить у авто-

матических промывателей) кусочками марли или ваты. Такое

засорение приводит к заносу растворов из одной лунки в другие,

оптическая плотность в соседних по ряду от сильноположительно-

го образца лунках повышена, при этом оптическая плотность тем

меньше, чем далее расположена лунка от положительного образца

(как при титровании).

Как ручные, так и автоматические промыватели в конце рабо-

чего дня следует тщательно промывать дистиллированной водой

для предотвращения проростов в шлангах.

Посуда

Посуда должна быть чистой. Необходимо выделить отдельную

посуду для приготовления и манипуляций с растворами конъюга-

та, ТМБ и ОФД. Посуду для растворов ТМБ, ОФД и конъюгата

необходимо мыть более тщательно, так как влияние возможных

загрязнений на эти растворы сильнее отражается на результате

анализа. Особенности мытья посуды и манипуляций с раствором

ОФД изложены в инструкциях по применению тест-систем.

Предлагаемая методика подготовки одноразовых наконечни-

ков к повторному использованию дана в приложении.

Термостаты

В целом, благодаря отсутствию подвижных деталей, термо-

статы редко выходят из строя. Однако желательно периодически

проверять температуру с помощью дополнительного контрольного

термометра. В некоторых термостатах неудачной конструкции мо-

жет наблюдаться высокая разность температур между нижней и

верхней полками.

Следует учитывать, что при низкой относительной влажнос-

ти в лаборатории (зимний период) или при низкой температуре

в помещении относительная влажность в термостате может стать

настолько малой, что даже при небольших временах инкубации

возможно подсыхание растворов в лунках. В таких случаях лучше

использовать влажную камеру или заклеивать планшет липкой

пленкой.

8

Спектрофотометры

Многоканальные спектрофотометры являются самыми слож-

ными из необходимых для постановки иммуноферментного анали-

за приборов.

Спектрофотометры различных фирм могут сильно отличать-

ся конструктивно, поэтому невозможно в рамках данной брошюры

указать на все возможные нарушения правил эксплуатации этих

приборов. Можно только отметить наиболее распространенные

ошибки и неисправности.

Во-первых, следует совместно со специалистами правильно

подключить прибор. Часто требования к колебаниям напряжения

в сети очень жесткие (обычно они указаны в инструкции к прибору),

специалисты на местах знают типичные колебания напряжения и

могут посоветовать те или иные меры противодействия.

Во-вторых, обычно спектрофотометры требуют длительного

времени прогрева, что указано в инструкции по эксплуатации.

Нарушение данного требования может привести к неправильному

измерению оптической плотности. Поэтому, если ожидается изме-

рение оптической плотности примерно через 30 минут после очеред-

ного измерения, прибор лучше оставить включенным. В большинстве

спектрофотометров наименьшим ресурсом обладает источник

света – мощная лампа, во многих инструкциях указан пересчет

влияния каждого включения на ресурс лампы (например, 1 вклю-

чение равносильно 40 минутам работы лампы).

Спектрофотометры обычно имеют допустимую погрешность

измерения до 10%. Проверить это можно, например, промеряя

дважды подряд один и тот же планшет сразу после постановки

ИФА и вычисляя различие в величине оптической плотности в

одинаковых лунках. При этом желательно развернуть планшет

так, чтобы лунка А1 заняла место лунки Н12. Следует учитывать,

что при оптической плотности выше 1,5 о.е. погрешность спектро-

фотометра может возрастать ввиду конструктивных особенностей

прибора.

Марля или фильтровальная бумага

В практике приходилось сталкиваться с такими случаями.

При удалении мелких капель из планшета (простукивание) ис-

пользовалась марля. Ввиду перебоев в снабжении марля исполь-

зовалась многократно, периодически обрабатывалась раствором

хлорамина. После одной из обработок марля не была достаточно

9

промыта от остатков хлорамина, что привело к попаданию хлора-

мина в лунки планшетов при простукивании. В результате в слу-

чайном наборе лунок наблюдалось повышение сигнала до 0,8 о.е.,

даже в контроле конъюгата. После смены марли «выбросы» по оп-

тической плотности исчезли.

Фильтровальную бумагу для простукивания желательно ис-

пользовать однократно.

Дистиллированная вода

Формальные требования к качеству дистиллированной воды

приведены в соответствующем ГОСТе (основные показатели: масса

сухого остатка после выпаривания – не более 5 мг/л, рН – 5,4–6,6,

удельная проводимость при 20°С – не более 0,0005 См/м). В прак-

тике приходилось сталкиваться с влиянием качества воды на ре-

зультат реакции во многих лабораториях.

Влияние качества дистиллированной воды на результат ре-

акции чаще наблюдается весной и осенью, что, по-видимому, свя-

зано с ухудшением качества водопроводной воды.

Правильная эксплуатация и своевременная профилактика

дистилляторов не является достаточным условием.

При долгом хранении дистиллированной воды возможен бак-

териальный пророст. Желательно не хранить дистиллированную

воду более 2–3 дней. Не следует добавлять в дистиллированную

воду в качестве консерванта азид натрия, так как он является

ингибитором пероксидазы и может повлиять на активность конъ-

югата при разведении. Если дистиллированная вода хранилась

в холодильнике, то перед приготовлением растворов для ИФА ее

следует прогреть до комнатной температуры, в противном случае

возможно понижение оптической плотности.

Планшет для предварительного

разведения сывороток

Если используется планшет для предварительного разведе-

ния сывороток, то следует использовать этот планшет однократно.

Нельзя применять для предварительного разведения неис-

пользованные планшеты из наборов с сорбированными антигена-

ми или антителами.

10

3. Подготовка образцов

Данная глава несколько выходит за рамки настоящей брошю-

ры, однако неправильное приготовление образцов может сущест-

венно повлиять на все последующие результаты анализа.

Рекомендуемое приготовление сыворотки: отстаивание 0,5–1 час

при 37°С в термостате для быстрого формирования фибринового сгус-

тка (не превратившийся в фибрин фибриноген является источником

ложнопозитивных реакций во многих тест-системах), центрифугиро-

вание 10 минут при 3 000 об/мин или 20 мин при 1 500 об/мин.

При приготовлении сывороток должны быть приняты все меры,

позволяющие исключить контаминацию.

Случай из практики: на одной из СПК количество ложно-

положительных результатов было намного выше обычного уров-

ня, при поиске причин удалось выяснить, что при заборе проб ис-

пользовалась стеклянная пипетка, которая ополаскивалась пе-

ред забором следующей пробы физраствором, в случае попадания

в исследуемые за день пробы высокотитражного образца количес-

тво ложноположительных реакций резко возрастало.

Более сложны для расследования случаи ошибочной марки-

ровки проб или сознательной их подмены.

11

4. Инструкция по применению

При получении новой серии наборов даже хорошо Вам знако-

мой тест-системы следует прочитать инструкцию. Прогресс в им-

муноферментном анализе в настоящее время сравним с прогрес-

сом в вычислительной технике. В связи с этим, практически все

тест-системы совершенствуются, что может отразиться на методи-

ках подготовки реактивов и протоколе реакции.

В случае возможных разночтений в инструкции лучше позво-

нить производителям и разрешить возникший вопрос – не следует

экспериментировать самим.

Наиболее распространенное сознательное нарушение инс-

трукции при постановке анализа – сокращение времени инку-

бации раствора ОФД, осуществляемое в целях уменьшения ко-

личества ложноположительных результатов. При этом причина

возникновения завышенного количества ложноположительных

результатов (заводской брак, неправильная транспортировка, не-

правильное хранение, неверная постановка анализа) не выясня-

ется и не устраняется. Такие изменения протокола ИФА могут су-

щественно снизить выявляемость слабоположительных образцов,

т.е. привести к ложноотрицательным результатам.

Многие требования к хранению реагентов, подготовке и

проведению реакции подразумеваются, но иногда не указаны в

инструкции. Ниже приведены некоторые из таких требований

(за основу взята инструкция по применению тест-системы Ortho

HCV v3.0).