Ошибки при постановке пцр

Команда «Биокор Текнолоджи» разрабатывает тест-системы и наборы для молекулярной диагностики методом ПЦР, и расскажет в этом материале, на какие детали стоит обратить внимание для предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

ПЦР является универсальным методом лабораторной диагностики, позволяющим идентифицировать даже не собственно вирус или бактерию в биологическом материале, а участки их РНК или ДНК.

Чувствительность ПЦР-анализа приближается к 10-100 копиям генетического материала возбудителя на реакцию. Для сравнения, если человек находится в активной фазе развития заболевания, то его биологический материал содержит миллионы геномов возбудителя на миллилитр, что, после выделения нуклеиновой кислоты будет равно нескольким тысячам копий на реакцию.

В мире, и в Украине в частности, с начала эпидемии COVID-19 ведутся дискуссии относительно того, насколько надежной является такая методика. Одни источники говорят, что ошибочным может быть каждый четвертый тест, другие указывают, что количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов составляет лишь несколько процентов. Учитывая актуальность темы, рассмотрим на примере ПЦР для диагностики COVID-19 по каким причинам могут возникать сомнительные или ошибочные результаты. Большинство указанных аспектов имеет место и в случае с ПЦР-тестированием других инфекционных заболеваний человека.

Особенности выбора места для взятия биологического материала

Такие возбудители, как SARS-CoV-2, способны поражать значительное количество органов. Для исследования на COVID-19 обычно берутся мазки из горла или носоглотки, где возбудитель в большом количестве находится ограниченное время — на 5-10 день от начала инфицирования, далее он спускается ниже — к бронхам и легким. Поэтому отрицательный результат ПЦР-теста не может исключать факта инфицирования пациента COVID-19.

С одной стороны, риски получить ложноотрицательный результат ПЦР-теста несколько возрастают на 1-7 день от начала инфицирования, когда количество вируса мало, а также на 10-30 день, когда, во-первых, COVID-19 уже «ушел» ниже, и, во-вторых, в организме уже присутствуют в достаточном количестве антитела, и размножение вируса более или менее эффективно сдерживается иммунной системой. С другой стороны, в некоторых случаях, мы можем получить сомнительно положительный результат ПЦР-теста даже на 60-й день от начала инфицирования, когда человек уже переболел, но в ее биологическом материале все еще можно найти обломки вируса. Все вышесказанное касается только некоторых отдельных случаев и не имеет характера «абсолютной закономерности».

Алгоритм тестирования регламентирован на государственном уровне и, если существует обоснованное подозрение на инфицирование COVID-19, для уточнения диагноза могут проводить ПЦР-анализ повторно.

Неправильное взятие биологического материала

Во избежание ложноположительных результатов вследствие загрязнения — попадание молекул ДНК/РНК из внешней среды, — клинический материал необходимо отбирать стерильными одноразовыми инструментами в одноразовые стерильные пробирки согласно установленным стандартам МОЗ. Взятие материала должны проводить медицинские работники, одетые в средства индивидуальной защиты.

Недостаточное количество биологического материала может привести к ложноотрицательным результатам исследования. В некоторых случаях, эту проблему можно отследить на этапе выделения нуклеиновых кислот или в процессе амплификации (при условии использованием в диагностических наборах для обнаружения SARS-CoV-2 внутреннего контроля, то есть фрагмента генома человека).

Несоблюдение температуры и сроков хранения

Учитывая возможность распада РНК в клиническом материале, сроки хранения и транспортировки должны быть минимальными. В идеальном случае все мазки нужно транспортировать в лабораторию в течение 24-48 часов с момента взятия в специальном транспортной среде при температуре плюс 4 °C. Транспортная среда должна содержать специальные реагенты — муколитики, обеспечивающие разрушение слизи, которая подавляет ПЦР. Если отсутствует возможность своевременно доставить образцы материалов в лабораторию, их можно замораживать до минус 70 °C, используя для этого твердую углекислоту — «сухой лед». Образцы можно хранить в лаборатории в течение недели при температуре минус 20 °C, или до месяца при температуре минус 70 °C. Критическим моментом является количество замораживаний/размораживаний образца: чем их больше, тем ниже качество образца и, вследствие этого, и чувствительность метода в целом.

В результате нахождения образцов в транспортной среде больше срока, рекомендованного производителем, происходит рост естественной бактериальной микрофлоры, которая обычно находится в ротовой полости человека, и разрушение молекул вирусной РНК в образце. При использовании специальных консервантов и стабилизаторов, биоматериал может храниться в температурном диапазоне в соответствии с инструкцией производителя сроком до месяца.

Выделение нуклеиновых кислот

ПЦР-исследование не проводится непосредственно на биологических образцах и требует предварительной пробоподготовки. На этом этапе большое значение имеет качество наборов для экстракции нуклеиновых кислот, которые должны обеспечить выделение образца соответствующей концентрации и степени очистки от примесей, подавляющие ПЦР. Из-за неправильного выбора набора также может быть потеряна часть или даже все РНК возбудителя, что может приводить к ложноотрицательным результатам. Качество и чистоту нуклеиновых кислот можно проверить с помощью специального аналитического прибора — спектрофотометра. Он есть во многих лабораториях, осуществляющих ПЦР-исследования.

Выделенную из образцов РНК можно хранить при температуре минус 20 °C до недели. Для более длительного хранения нужна температура минус 70 °C. Также можно использовать специальные реагенты, стабилизирующие РНК и предупреждают ее деградации (например, DEPC — диэтилпирокарбонат).

Амплификация

Процесс амплификации (увеличение копий участков ДНК, которые обычно содержат необходимые фрагменты целевых генов) может включать до 45 циклов, во время каждого из них количество копий удваивается. Он обеспечивается реагентами, которые входят в диагностические наборы для выявления SARS-CoV-2, и приборами, обеспечивающими циклическую смену температур — амплификаторами.

Для обеспечения корректных результатов, качество диагностических наборов является первоочередным требованием. Также лаборатории должны проводить процедуру их верификации, проведя сравнительные испытания с собственными панелями референтных образцов и решениями от других производителей. Наборы должны поступать в лаборатории в термобоксах с холодовыми блоками и храниться при температуре минус 20 °C. Несоблюдение условий их транспортировки или хранения приводит к повреждению компонентов наборов, и, вследствие того, к ложноотрицательным результатам. Чтобы предупредить эту ошибку, в состав каждого диагностического набора входит положительный контрольный образец, задачей которого является установление работоспособности реагентов.

Диагностические наборы должны быть совместимыми с амплификаторами, используемыми в лаборатории. Реагенты, входящие в состав набора, меченные различными флуоресцентными красителями. Детекция флуоресцентного сигнала от каждого красителя происходит в определенном диапазоне (на определенном «канале»). Если прибор имеет слабую чувствительность по определенным флуоресцентным каналам, это может приводить к ошибочным результатам. Во избежание ошибок работники лабораторий должны проверять исправность работы приборов, а также настройки параметров работы и протоколов амплификации.

Контаминация образцов

При несоблюдении мер безопасности в помещениях лаборатории могут накапливаться продукты амплификации. Это приводит к контаминации образцов, и, в общем итоге, к ложноположительным результатам. Для подтверждения отсутствия загрязнения, каждую серию ПЦР-исследований нужно сопровождать постановкой негативных контрольных образцов, включенных в состав диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Перекрестная контаминация может возникать из-за попадания аэрозольных частиц от соседнего образца, содержащего вирусную РНК, при внесении образцов в ПЦР-смесь. На этапе амплификации контаминированный образец издает слабый положительный результат, который означает, что в исследуемой пробе обнаружено очень малое количество вируса. Но такой результат также может указывать, что человека тестировали до наступления полного выздоровления и уровень вируса в его организме был низким.

Способы предупреждения контаминации — использование наконечников с фильтрами, химическая и ультрафиолетовая дезинфекция всех рабочих поверхностей, наличие отдельных наборов дозаторов, оборудования, халатов и перчаток для каждой зоны, проведения внутрилабораторного и внешнего контроля качества исследований — регламентированы на государственном уровне.

Другими эффективными, однако дорогостоящими мероприятиями для предотвращения контаминации является автоматизация этапов выделения нуклеиновых кислот и амплификации, а также двойной контроль — постановка каждого образца в двух параллельных реакциях.

Ошибки обработки данных

Расчеты результатов ПЦР в реальном времени проводятся с использованием компьютерных программ. Амплификатор в автоматическом режиме измеряет интенсивность флуоресценции в образцах на каждом цикле. Кривая амплификации имеет так называемую фазу экспоненциального роста, после которой следует фаза плато. Автоматическая интерпретация результатов не всегда дает правильный результат, поэтому рекомендуется проводить анализ кривых амплификации на предмет пересечения пороговых значений, и корректировать задачи пороговых значений по мере необходимости. Для большей достоверности можно сравнить такую ​​сомнительную кривую с кривой подтвержденного положительного образца.

Подытожим

На каждом этапе исследования являются условия, несоблюдение которых может привести к недостоверным результатам. Некоторые из потенциальных ошибок являются общими для большинства видов лабораторной диагностики (например, ошибки при взятии и хранения образца, настройка оборудования), тогда как другие являются специфическими только для этого вида исследования (например, контаминация образцов, низкое качество выделенных нуклеиновых кислот).

ПЦР — многостадийный метод, и для получения максимально достоверных и воспроизводимых результатов необходимо надлежащее выполнение каждого этапа процесса в соответствии со стандартами МОЗ и инструкциями производителей. Вторым важным условием является качество всех реагентов и расходных материалов, используемых в ПЦР: систем для сбора биологических материалов, наборов для выделения нуклеиновых кислот, диагностических наборов для выявления SARS-CoV-2.

Полимеразно-цепная реакция, пожалуй, один из самых чувствительных и наиболее точных методов диагностики различных инфекционных заболеваний, особенно, передающихся половым путем. Определяя даже незначительное количество частиц ДНК бактерий, вирусов, грибов, ПЦР является и достаточно специфичным методом, редко дающим ложноположительные результаты.

Ложноположительный результат означает, что на самом деле инфекции нет, а реакция положительная.

Но, даже имея 98-99% точности, при ПЦР иногда также бывают неверные ответы, которые практически никогда не связаны с самой реакцией, а больше с нарушениями на предварительном этапе.

Причины ложноположительного результата анализа ПЦР:

• Не выдержаны сроки для проведения контрольных анализов после лечения половых инфекций. Дело в том, что большинство инфекций находятся внутри клеток или фиксированы на поверхности их мембран. Во время полноценного лечения возбудитель ИППП погибает, но частицы его генома (ДНК) остаются еще некоторое время в организме хозяина. Нужно время, порядка 3 недель, чтобы эти клетки заменились на новые, не контактировавшие с инфекционным агентом, тогда и берется контроль. Если же взять анализ раньше, то, благодаря своей высокой чувствительности, ПЦР определит ДНК уже погибших бактерий и укажет на наличие возбудителя, что будет являться ложноположительным, так как инфекция уже погибла.
  Наши врачи обладают достаточными знаниями в области диагностики ЗППП и выдерживания сроков, поэтому такие ситуации в клинике Частная практика исключены.
• Попадание ДНК инфекций, передающихся половым путем, в пробирку с рук венеролога, с перчаток и урологических зондов.
  Данный фактор исключен, так как для забора материала используются только одноразовые перчатки, пробирки и зонды.
• Крайне редко встречаются ложноположительные результаты при наличии в соскобе близкородственных микроорганизмом. То есть анализатор выдает наличие патогенной бактерии, вызывающей венерическое заболевание, а на самом деле это компонент нормальной микрофлоры. Но эта проблема уже давно решена внедрением более современных и специфических тест-систем.
• Контаминация или занесение ДНК инфекций в пробирку на лабораторном этапе исследования тоже был когда то возможен, но практически исключен правильной организацией процесса диагностики и обучением персонала.

В любом случае диагноз ставится всегда не только на основании результатов одного анализа. Окончательный диагноз заболевания, передающегося половым путем, это совокупность жалоб, клинического осмотра и комбинации различных лабораторных и инструментальных методов.

Если у уролога, гинеколога или венеролога появляются сомнения в правильности полученных результатов ПЦР или выявляется несоответствие имеющейся клинической картины и данных лабораторной диагностики между собой, то врач всегда порекомендует дообследование с применением методов ИФА, НАСБА, посевов, с целью уточнения ситуации.

В наших клиниках есть все доступные современной медицине методики обследования мужчин и женщин. Поэтому установление ложных диагнозов ИППП исключено.

Врач клиники «Частная практика» дерматовенеролог, уролог Волохов Е.А. рассказывает об анализе ПЦР на инфекции.

Введение. COVID-19 – острая респираторная инфекция, вызванная коронавирусом SARS-CoV-2 (2019-nCoV), ассоциированная с высоким уровнем летальности среди лиц старшей возрастной группы и с сопутствующими заболеваниями сердечно-сосудистой и эндокринной систем. Инфекция в короткий срок распространилась по всему миру и приобрела характер пандемии [1][2]. По состоянию на 23 июля 2021 г. в мире зарегистрировано более 186 млн случаев новой коронавирусной инфекции, в России – свыше 6 млн случаев. Новый коронавирус SARS-CoV-2 относится к роду Betacoronavirus, подроду Sarbecovirus, генетически близок к коронавирусам SARS-CoV и MERS-CoV (возбудителями SARS и MERS). Геном вируса представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности, включает один линейный сегмент размером около 30 000 нуклеотидных оснований [3–7]. Коронавирус SARS-CoV-2 предварительно отнесен ко II группе патогенности, в соответствии с принятой в Российской Федерации классификацией биологических агентов, вызывающих болезни человека.

Лабораторная диагностика – важная составляющая часть комплекса мероприятий, направленных на борьбу с распространением COVID-19. Массовое тестирование населения на наличие РНК нового коронавируса SARS-CoV-2 необходимо для своевременного выявления больных новой коронавирусной инфекцией среди людей с симптомами ОРВИ и пневмонии, обследования контактных, активного выявления бессимптомных носителей вируса. Получение достоверных результатов лабораторных исследований на COVID-19 в короткие сроки имеет существенное значение для повышения эффективности мероприятий, направленных на предупреждение распространения инфекции.

Диагностика СOVID-19, основанная на детекции РНК коронавируса SARS-CoV-2 в биологическом материале человека методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР или ОТ-ПЦР), получила наиболее широкое распространение.

ОТ-ПЦР – высокочувствительный тест, широко применяющийся для лабораторной диагностики вирусных инфекций, является «золотым стандартом» для специфической лабораторной диагностики COVID-19 [8–12]. В то же время при проведении исследований клинического материала методом ПЦР на наличие РНК коронавируса SARS-CoV-2 в начале пандемии COVID-19 лабораторная служба в России и зарубежных странах столкнулась с проблемами точности диагностики, получением ложноотрицательных, ложноположительных и сомнительных результатов [13][14].

Цель работы – анализ литературных источников по вопросам получения ошибочных результатов ПЦР-исследований клинического материала на COVID-19, а также проблеме возникновения контаминации в лабораториях, выполняющих исследования клинического материала на наличие РНК нового коронавируса SARS-CoV-2 методом ПЦР в период пандемии COVID-19.

Материалы и методы. Поиск источников литературы осуществлялся в базах eLibrary, Google Scholar, PubMed, Science Direct, Scopus по ключевым словам: «ложноположительные и ложноотрицательные результаты ПЦР на наличие РНК вируса SARS-CoV-2», «ДНК-контаминация при исследовании на наличие вируса SARS-CoV-2», «ошибки ПЦР-диагностики COVID-19». Для анализа отобраны российские и зарубежные статьи, опубликованные на английском языке в течение 2019–2020 гг., посвященные вопросам лабораторной диагностики новой коронавирусной инфекции, работы, рассматривающие проблемы лабораторной диагностики методом ПЦР SARS и MERS и общие проблемы ДНК-контаминации в ПЦР-лаборатории (2012–2020 гг.). Также проанализирована действующая нормативно-методическая документация, регламентирующая проведение лабораторной диагностики новой коронавирусной инфекции методом ПЦР.

Результаты. Причины получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования методом ПЦР на наличие РНК вируса SARS-CoV-2

Ошибочные результаты ПЦР могут быть связаны с неправильным отбором клинических образцов, нарушениями температурного режима при хранении и передаче образцов в лабораторию. Качество выделенного препарата РНК также влияет на точность результата ПЦР. Так, деградация образцов РНК, а также наличие ингибиторов ОТ-ПЦР в реакционной смеси могут привести к ложноотрицательным результатам [15][16]. Перекрестное загрязнение образцов (контаминация) в процессе отбора, при проведении выделения РНК, внесения проб в реакционную смесь для ПЦР – основная причина ложноположительных результатов. В соответствии с данными, представленными в зарубежных публикациях, доля ложноположительных результатов при проведении исследований клинического материала методом ПЦР на наличие РНК коронавируса SARS-CoV-2 составляет 0,8–4,0 % [17–20].

Последствия ошибок лабораторной диагностики всегда значительны, однако в период пандемии COVID-19 при массовых обследованиях их негативное влияние на эффективность работы систем здравоохранения и эпидемического надзора существенно усиливается. Ложноотрицательные результаты являются фактором, способствующим несвоевременным изоляции носителей вируса и введению ограничительных мер.

Негативное влияние ложноположительных результатов заключается в получении некорректных (завышенных) данных об уровне заболеваемости COVID-19, безосновательной изоляции или госпитализации неинфицированных лиц, что увеличивает нагрузку на медицинский персонал и лабораторную службу [21][22]. Госпитализация неинфицированных лиц в связи с ложноположительными результатами ПЦР на SARS-CoV-2 значительно повышает риск их инфицирования в стационаре.

Контаминация нуклеиновыми кислотами (НК) – одна из проблем, возникающая при выполнении ПЦР-исследований, приводящая к ложноположительным результатам тестирования и связанная с высокой чувствительностью метода и особенностями методики постановки анализа. Проведение массового обследования населения на COVID-19 в период пандемии способствовало резкому увеличению нагрузки на лаборатории, выполняющие ПЦР. Поступление и накопление в лаборатории большого количества образцов клинического материала, увеличение объемов медицинских отходов, в т. ч. содержащих продукты амплификации, – основные причины, повышающие риск возникновения контаминации.

Основными источниками контаминации, приводящей к возникновению ложноположительных результатов, являются продукты ПЦР (ДНКампликоны), исследуемые пробы, содержащие целевую РНК (нативный материал, выделенная РНК/кДНК), а также положительные контрольные образцы, представляющие собой препараты рекомбинантной ДНК/РНК со встроенным участком гена-мишени, детектируемого диагностической ПЦР-тест-системой.

Выделяют перекрестную контаминацию – механический занос целевой НК из одной пробирки в другую в процессе пробоподготовки, выделения НК, внесения пробы в реакционную смесь и тотальную контаминацию – загрязнение поверхностей и воздуха лаборатории ампликонами.

Причины возникновения контаминации в лаборатории при проведении лабораторной диагностики COVID-19 методом ПЦР

Выполнение большого объема диагностических исследований на основе ПЦР, что имеет место при массовом обследовании населения на COVID-19, характеризуется повышенным риском контаминации на всех этапах анализа.

Преаналитическая стадия лабораторного исследования является основным источником ошибок в лаборатории, в т. ч. при проведении ПЦР [15]. На стадии отбора материала причиной контаминации может являться нарушение техники отбора проб (в т. ч. использование нестерильных медицинских инструментов, загрязненных перчаток), приводящее к механическому заносу нативного материала, содержащего РНК вируса SARS-CoV-2, в другие пробы. Исследование смывов с поверхностей и проб воздуха в помещениях «красной зоны» инфекционных стационаров, осуществляющих лечение больных с COVID-19 в Китае, показало наличие РНК коронавируса SARS-CoV-2 в образцах, отобранных в 56,7 % помещений [23–25].

На этапах первичной подготовки и обеззараживания образцов, выделения РНК, внесения проб РНК/кДНК и контрольных образцов в реакционную смесь для проведения реакции обратной транскрипции и ПЦР перекрестная контаминация возникает вследствие несоблюдения техники выполнения лабораторных манипуляций (ошибки пипетирования, касание одноразовым наконечником внутренних поверхностей пробирок, отсутствие смены перчаток при выполнении работ на разных этапах ПЦР и др.) [26].

Тотальная контаминация возникает при загрязнении рабочих зон лаборатории, оборудования и одежды сотрудников ампликонами, следами геномной РНК, попадающими в воздух лабораторных помещений, на лабораторную мебель и оборудование из пробирок и планшетов с продуктами ПЦР, с рук операторов и распространяющимися по всем рабочим зонам лаборатории. Наиболее частым источником тотальной контаминации являются случайно открывшиеся пробирки с продуктами ПЦР [26]. Другой причиной тотальной контаминации может являться процесс инактивации ампликонов путем автоклавирования (в случае нарушения целостности пакетов для автоклавирования)¹.

В зарубежных публикациях описана контаминация реактивов целевыми геномными последовательностями вируса SARS-CoV-2 в процессе производства диагностических наборов. Ряд лабораторий, выполняющих исследования на наличие РНК коронавируса SARS-CoV-2, в странах Европы и США сообщили о контаминации изготовленных на заказ партий праймеров и зондов геномными последовательностями нового коронавируса, что привело к ложноположительным результатам ПЦР. Специфическая флуоресценция отмечалась при проведении амплификации реакционных смесей без внесения матрицы и с внесением отрицательного контрольного образца. Степень загрязнения реакционных смесей в лабораториях существенно различалась, зарегистрированные значения порогового цикла (Ct) составляли от 23 до 39. Анализ потенциальных источников контаминации исключил возможность попадания целевой НК в реакционную смесь вследствие ошибок при проведении манипуляций в лаборатории. Контаминация реакционных смесей для проведения исследований методом ПЦР на наличие РНК вируса SARS-CoV-2 привела к задержке получения результатов тестирования клинического материала на 2–14 дней [27].

Для обеспечения высокого уровня диагностической точности настоятельно рекомендуется предварительно тестировать каждую партию диагностических наборов для ПЦР с использованием отрицательных контрольных образцов с целью исключения контаминации реакционных смесей [27].

Признаки контаминации в лаборатории при проведении диагностики COVID-19 методом ПЦР

Анализ накопленного опыта по проведению диагностики COVID-19 методом ПЦР с использованием различных диагностических тест-систем (в т. ч.: «Вектор-ПЦРрв-2019-nCov-RG» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора), «АмплиТест SARS-CoV-2» (ФГБУ «ЦСП» Минздрава России), «АмплиСенс CoV-Bat-FL» (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), «COVID-19 Amp» (ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера»)) позволил выявить основные признаки контаминации в лаборатории, выполняющей ПЦР, и предложить тактику проведения дополнительных исследований для верификации полученных результатов при подозрении на контаминацию.

Основные признаки контаминации в лаборатории, выполняющей исследования методом ПЦР, и необходимые действия при возникновении ситуации следующие.

1. Выявление положительного сигнала в отрицательном контрольном образце этапа выделения свидетельствует о загрязнении исследуемых образцов целевой РНК, или положительным нативным материалом, или положительным контрольным образцом на этапах первичной пробоподготовки, обеззараживания образцов или выделения РНК. Необходимо повторное исследование всех положительных образцов, начиная с этапа выделения РНК.

2. Выявление положительного сигнала в отрицательном контрольном образце этапа амплификации свидетельствует о загрязнении реакционной смеси на этапе ее приготовления или внесения образцов в реакционную смесь для ПЦР. Необходимо повторное исследование всех положительных образцов, начиная с этапа постановки ПЦР.

3. Существенное увеличение (в 1,5–2 раза и более) доли положительных образцов по сравнению с ожидаемой в обследуемой группе (регионе), в особенности числа проб с низкой нагрузкой целевой НК со значениями Ct > 30, может свидетельствовать о кросс-контаминации на любом из этапов анализа. Необходимо выборочное повторное исследование положительных образцов, начиная с этапа выделения РНК, в т. ч. с использованием альтернативных ПЦР-тест-систем (с праймерами на другие РНК-мишени) [2][3].

4. Получение положительного результата для 90–100 % образцов, включая отрицательные контроли этапов выделения и амплификации, свидетельствует о загрязнении реакционной смеси для ПЦР целевой НК. Необходимо проведение повторного тестирования проб, начиная с этапа постановки ПЦР. Повторное получение положительного результата для всех исследуемых и контрольных образцов является признаком тотальной контаминации в лаборатории. Необходимо проведение полномасштабных деконтаминационных мероприятий [3]. В случае загрязнения рабочих зон лаборатории ампликонами при отсутствии возможности остановить проведение лабораторных исследований необходимо тестировать образцы с помощью альтернативных ПЦР-тест-систем.

5. Получение положительного результата при исследовании контрольных смывов, выполняемых в соответствии с действующими нормативными документами для контроля контаминации в лаборатории, осуществляющей диагностические исследования методом ПЦР, требует проведения дополнительных мероприятий по ликвидации контаминации.

Необходимо отметить, что в случае контаминации образцов нативным материалом на этапе первичной пробоподготовки образцов повторное тестирование проб, в т. ч. с использованием альтернативных наборов реагентов, также покажет положительный результат. Предположить возникновение перекрестной контаминации образцов на этапе пробоподготовки можно в случае получения отрицательного ответа при исследовании образцов клинического материала от больного после повторного забора материала.

Мероприятия, направленные на недопущение возникновения контаминации в лаборатории, и мероприятия по ликвидации последствий контаминации описаны в МУ 1.3.2569–09².

Мероприятия, препятствующие возникновению контаминации в лаборатории, выполняющей ПЦР, в т. ч. при проведении диагностики COVID-19, включают:

• выделение отдельных рабочих зон для различных этапов анализа в лаборатории, в особенности выделение отдельного помещения для проведения амплификации, автоклавирование продуктов амплификации в отдельной зоне;
• соблюдение поточности движения исследуемого материала и медицинских отходов, в т. ч. пробирок с ампликонами;
• обязательную постановку отрицательных контролей на этапах выделения и амплификации;
• строгое соблюдения порядка внутрилабораторного контроля качества (исследование смывов с лабораторных поверхностей и оборудования с целью контроля контаминации, выборочное повторное тестирование образцов);
• соблюдение техники пипетирования, использование одноразового стерильного пластикового расходного материала (наконечников для дозаторов, микропробирок), наконечников с фильтром на этапах работы с нативным материалом, РНК, кДНК, перчаток и отдельных комплектов защитной одежды в каждой рабочей зоне, обработку рук, правильное пипетирование жидкостей.

Мероприятия по ликвидации контаминации в лаборатории:

• расходный материал, реактивы, защитную одежду в контаминированной зоне утилизируют;
• проводят обработку рабочих и лабораторных поверхностей с использованием дезинфицирующих средств (0,2 % ДП-2Т) или реактивов для разрушения ДНК (DNA-exitusplus (AppliChem) и аналогичные) с экспозицией 30 мин, по окончании которой остатки дезинфектанта тщательно удаляют смоченной в воде ветошью;
• проводят обеззараживание рабочих и лабораторных поверхностей ультрафиолетовым излучением в течение 45 мин;
• вышеуказанные манипуляции по обработке повторяют дважды;
• исследуют смывы с лабораторных поверхностей и оборудования с целью контроля контаминации.

При соблюдении всех требований, указанных в МУ 1.3.2569–09, вероятность возникновения ДНК контаминации в лаборатории минимальна. Порядок проведения деконтаминационных мероприятий, описанный в МУ, позволяет в короткие сроки ликвидировать контаминацию.

Повышенный риск контаминации в лабораториях, выполняющих большое количество анализов на COVID-19, обусловливает необходимость постоянного контроля за выполнением требований МУ1.3.2569–09.

Причины возникновения ложноположительных результатов ПЦР, не связанные с контаминацией

Ложноположительные результаты исследования при проведении ПЦР могут быть связаны не только с контаминацией проб (реактивов) и возникать вследствие образования неспецифических продуктов ПЦР или неспецифической флуоресценции реакционной смеси.

Вероятность образования неспецифических продуктов ПЦР повышается на поздних циклах термоциклирования. Их появление может быть связанно с завышенной концентрацией праймеров, возникающей вследствие неправильного приготовления смеси для ПЦР, ошибками в программировании прибора для проведения ПЦР в реальном времени.

При учете результатов ПЦР для дифференциации положительного сигнала и образовании неспецифического продукта реакции необходимо оценивать форму кривой флуоресценции (кривая должна быть S-образная, со значением флуоресценции в стадии плато, сопоставимым со значением максимального уровня флуоресценции положительного контрольного образца).

Эффект неспецифической флуоресценции реакционной смеси связан с ошибками приготовления реакционной смеси (неправильное соотношение компонентов, приводящее к изменению концентрации праймеров) либо неправильным хранением ПЦР-смеси до внесения проб (длительное хранение при комнатной температуре), приводящим к деградации зондов. Эффект неспецифической флуоресценции отличается от признаков контаминации одинаковым уровнем флуоресценции всех проб, что редко наблюдается при контаминации, поскольку маловероятно, что во все пробирки попадет одинаковое количество специфических ампликонов³. Для решения проблемы неспецифической флуоресценции необходимо соблюдать температурные условия хранения тест-систем, размораживать реактивы и готовить реакционную смесь непосредственно перед постановкой ПЦР.

Заключение. Проблема контаминации в лабораториях, выполняющих ПЦР, при диагностике COVID-19 обострилась в связи с необходимостью проведения большого объема исследований. Негативные последствия контаминации нуклеиновыми кислотами заключаются в получении ложноположительных ответов, необходимости останавливать проведение лабораторных исследований на время проведения и контроля деконтаминационных мероприятий.

Для минимизации риска возникновения контаминации в условиях массового скрининга на COVID-19 следует строго соблюдать поточность движения исследуемого материала и медицинских отходов, в особенности пробирок, содержащих продукты ПЦР. Важную роль в предотвращении контаминации играет организация внутрилабораторного контроля качества, включающего обязательную постановку отрицательных контролей выделения и амплификации, проведение плановых контрольных исследований для выявления контаминации и строгий контроль выполнения таких мероприятий.

Для снижения вероятности появления ложноположительных результатов целесообразно проводить выборочное подтверждающее тестирование положительных проб с использованием альтернативных ПЦР-тест-систем для выявления РНК SARS-CoV-2.

Действующие МУ 1.3.2569–09 подробно описывают требования к организации лабораторий, занимающихся молекулярно-генетическими и диагностическими исследованиями на основе ПЦР, а также требования к проведению работ с НК, направленные на предотвращение контаминации и ликвидацию ее последствий.

Real-Time PCR: Как избежать ошибок

Ключевые факторы, оценка значения C_T, применение на практике

ПЦР в реальном времени (также известна как количественная ПЦР, real-time PCR, или qPCR) является простой и эффективной методикой количественного определения целевой последовательности ДНК в образцах. Зачастую, по причине крайней простоты освоения и выполнения данной методики, некоторые факторы, оказывающие критическое влияние на успешность метода, остаются без внимания. В этом обзоре мы рассмотрим ключевые факторы, которые необходимо учитывать при подготовке и интерпретации результатов real-time PCR.

Факторы, влияющие на C_T

C_T-величина (англ. Threshold cycle – пороговый цикл) – это значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются (рис. 1B). Это значение является относительным показателем содержания ДНК-матрицы в образце, так как различия в количестве молекул матрицы в начале реакции влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума. Кроме того, на абсолютное значение C_T влияет множество других факторов, которые не зависят от изначального количества ДНК-матрицы в реакции. В данной статье мы обсудим самые часто встречаемые факторы, влияющие на значение C_T и выясним, как правильно оценивать эффективность прохождения real-time PCR.

На рисунке 1 изображены некоторые параметры кривой амплификации. Экспоненциальная фаза на рисунке 1B соответствует линейной фазе кривой на рисунке 1C. На рисунке 1C пороговое значение должно пересекать линейный участок кривой амплификации. Значение C_T обратно пропорционально количеству ДНК-матрицы в реакции, то есть чем меньшее количество ДНК-матрицы находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового количества продукта амплификации. Однако любые изменения в составе реакционной смеси или настройках детектора флуоресценции могут оказывать влияние на значение C_T. Соответственно, значение C_T для реакций, которые были проведены при разных условиях или в которых были использованы разные реактивы, не могут быть непосредственно сравнены друг с другом.

Рисунок 1:  A: Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя. Другими словами, Rn – это репортерный сигнал, нормализованный к сигналу ROXÔ. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение Rn.

B: Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение ΔRn.

C: График кривой амплификации представлен в виде логарифмической функции Log(ΔRn) от номера цикла.

Влияние компонентов реакционной смеси

Интенсивность флуоресценции каждой молекулы зависит от внешних факторов, к ним относятся, например, pH или концентрации солей в реакционной смеси. На рисунке 2 изображён график флуоресценции зонда TaqMan® в двух различных реакционных смесях. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции в реакционной смеси A выше, несмотря на одинаковую концентрацию ДНК-матрицы, зонда и красителя ROX™ в обеих смесях.

Рисунок 2: Пики флуоресценции, полученные при анализе двух разных реакционных смесей с одинаковым количеством ROX™. Различия в значении сигналов обусловлено составом реакционных смесей. На этом рисунке ось X отображает длину волны флуоресценции, ось Y – интенсивность свечения флуорофора.

В результате, значение ΔRn будет различным, это отображено на рисунке 3. Обратите внимание, что базовые линии для двух реакционных смесей различны (рисунок 3А). Различие в значении C_T не отображает общую производительность реакционной системы (рисунок 3B). Реакционные смеси с эквивалентными показателями чувствительности могут иметь различные абсолютные значения C_T.

На рисунке 3 в реакционных смесях A и B была проведена амплификация гена РНКазы P человека. В обеих образцах было использовано одинаковое количество геномной ДНК. На рисунке 3A показана зависимость Rn от номера цикла и базовые линии для обеих реакций. На рисунке 3B показана зависимость значения Log (ΔRn) от номера цикла. Значение порога чувствительности (зеленая прямая) одинаково для обеих реакций. Пороговый цикл C_T для реакционной смеси B (C_TB) наступает раньше, чем для реакционной смеси A (C_TA) при одинаковом количестве ДНК-матрицы в обеих образцах.

Пассивный референтный краситель ROX™

Величина Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции красителя FAMÔ к  флуоресценции красителя ROX. Таким образом, если концентрация красителя ROX будет меньше, а концентрация FAM останется неизменной, величина Rn будет выше. Это приведет к тому, что значение базовой линии станет выше, и вследствие этого, ΔRn будет меньше, что в конечном итоге приведет к другому значению C_T. Различие в значениях C_T при уменьшенных концентрациях ROX не является показателем увеличения чувствительности реакции, при этом могут появиться другие нежелательные последствия. Низкая концентрация ROX в реакционной смеси может привести к увеличению стандартного отклонения значения C_T, как показано на рисунке 4. Чем больше стандартное отклонение, тем менее достоверны данные, особенно если есть необходимость детектировать небольшие различия концентрации целевой последовательности ДНК. (Более подробно это описано в разделе Точность).

На Рисунке 4. В трех реакционных смесях с различным содержанием ROX™ была проведена амплификация Трансформирующего ростового фактора бета (TGF beta). На рисунке 4A изображено значение C_T, на рисунке 4B изображено стандартное (среднеквадратическое) отклонение. Чем меньше концентрация ROX, тем раньше наступает пороговый цикл, но это увеличивает стандартное отклонение.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину C_T. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения C_T при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение C_T при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рис. 5. Синяя стандартная кривая отображает 100% эффективность реакции (наклон -3,3). Зеленая стандартная кривая отображает 78% эффективность реакции (наклон -4). При амплификации Y молекул ДНК-матрицы в условиях низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает раньше, чем в условиях высокой эффективности реакции. При меньшем количестве молекул ДНК-матрицы происходит наоборот – при низкой эффективности реакции пороговый цикл наступает позже, чем в условиях высокой эффективности реакции.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении C_T для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях C_T не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения C_T имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Как оценить эффективность ПЦР в реальном времени

В случае, если какие-либо условия эксперимента были изменены (например, анализ проводился на разном оборудовании или в разных реакционных смесях), необходимо учитывать следующие параметры.

Динамический диапазон

 Для того, чтобы точно оценить эффективность реакции, необходимо провести, как минимум, 3 повторения реакции при концентрации ДНК-матрицы 5 log (10⁵ копий ДНК-матрицы на образец). Причина такой необходимости проиллюстрирована на рисунке 6. На нем отображено изменение угла наклона графика зависимости величины C_T при различных градиентах разведения ДНК-матрицы (1 log и 5 log). То есть, если мы будем проводить тестирование серии разведений при концентрации 1 log, и получим показатель 100% эффективности реакции, в реальности, разброс данного показателя будет находится в диапазоне 70-170%. Делая тот же самый тест при концентрации ДНК-матрицы 5 log, потенциальный разброс будет составлять всего ± 8%. То есть, если мы получили значение, например, 94% эффективности (при концентрации 5 log), то действительная эффективность реакции будет в диапазоне 88-100%. Из этого можно сделать вывод, что определять эффективность реакции необходимо при концентрации ДНК-матрицы 5 log. Уклон графика -3,3 ± 10% свидетельствует о 100%  ± 10% эффективности полимеразной цепной реакции. Более низкие значения эффективности ПЦР свидетельствуют о низкой чувствительности метода при данных условиях.

На Рисунке 6 точный расчет эффективности реакции, сделанный на основе серии разведений ДНК-матрицы. Для двукратного разведения на 5 точках (оранжевый) потенциальный разброс значений выше, чем для десятикратного разведения на 5 точках (синий).

Значение R²

Еще одним параметром, без которого невозможно точно рассчитать эффективность реакции, является коэффициент детерминации (R²). В математической статистике этот параметр показывает, насколько точно мы можем спрогнозировать значение некой величины, зная другую. Если R²=1, тогда можно точно установить корреляцию величины X (количество ДНК-матрицы) к Y (значению C_T) (рисунок 7A). Если R²=0, тогда невозможно определить корреляцию величины X к величине Y (рисунок 7B). Значение R²>0,99, в целом, обеспечивает достаточную точность определения корреляции.

На Рисунке 7 пример расчета R² для двух прямых. A: между x и y нет прямой корреляции. B: между x и y есть прямая корреляция.

Точность

Наиболее используемым способом расчета точности метода является вычисление стандартного отклонения (квадратный корень из вариансы). Если множество результатов имеют небольшой разброс относительно средней величины, тогда стандартное отклонение имеет малое значение, если же разброс велик, то стандартное отклонение больше.

На практике, большая выборка представляет собой распределение, близкое к нормальному. Это следствие центральной предельной теоремы, она гласит, что суммы многих независимых, одинаково распределенных случайных величин стремятся к нормальному распределению как к пределу. На рисунке 8А значения распределены таким образом, что 68% из них находятся в пределах одного стандартного отклонения, 95% – в пределах 2 стандартных отклонений, и 99,7% находится в пределах 3 стандартных отклонений.

Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (рисунок 8B). Для того чтобы определить количество ДНК-матрицы в диапазоне двукратных разведений в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,167. Чем больше стандартное отклонение, тем меньше вероятность достоверно найти разницу между образцами. Чтобы найти разницу между образцами в диапазоне двукратных разведений в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,250 (рисунок 8C).

На Рисунке 8 нормальное распределение и стандартное отклонение.  На рисунке (A) показано нормальное распределение результатов анализа. Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (образцы X и Y). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 6 стандартных отклонений (1/6=0.167), как показано на рисунке (B). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 4 стандартных отклонений (1/4=0.25), как показано на рисунке (C).

Чувствительность

Любая из современных систем ПЦР в реальном времени достигла такого уровня чувствительности, что стало возможно детектировать единичную копию ДНК-матрицы в образце. Чувствительность не зависит от абсолютного значения C_T.

Как было сказано ранее, ключевым фактором для расчета чувствительности метода является эффективность реакции (рисунок 5). Другим важным моментом, связанным с детекцией малого количества копий ДНК является то, что распределение ДНК-матрицы будет отличаться от нормального. Вместо этого, оно будет стремиться к распределению Пуассона: то есть, если мы имеем большую выборку повторений, в каждом из которых, в среднем, по одной копии ДНК-матрицы, то, согласно распределению, в 37% образцов не будет ни одной копии, 37% будут иметь одну копию, а 18%  – по две копии ДНК-матрицы (см. рисунок 9). Следовательно, для того, чтобы обеспечить достаточную достоверность детекции малого количества ДНК, необходимо проводить достаточное количество повторений, для того, чтобы обойти ограничения, связанные с распределением Пуассона.

Вывод

Вышеописанные факторы: эффективность реакции, R², точность и чувствительность метода необходимо учитывать при сравнении результатов ПЦР анализа при различающихся условиях реакции. Для более точных результатов сравнения, все факторы, указанные в табл. 1 должны быть учтены вместе.

Вместе с тем, дополнительные виды контроля, такие как NTC (отрицательный контроль), no RT-контроль (контроль без обратной транскрипции) и контроль качества ДНК должны быть проведены для каждого анализа.

Попробуем применить полученные знания на примере.

В фермерском хозяйстве выявили нескольких животных с симптомами африканской чумы. Как известно, заболевание это очень «коварно»: оно может проходить как и остро, так и бессимптомно. Из-за этого болезнь распространяется крайне непредсказуемо, что чревато потерей всего поголовья свиней.

Африканская чума свиней – это вирусное заболевание. Особенностью любых вирусных заболеваний является то, что в организме хозяина вирус представлен не только в виде отдельных возбудителей-вирионов, но также и в виде молекул вирусной ДНК.

Все классические методы диагностики – патологоанатомические, иммунологические и т.п. являются косвенными, и иногда невозможно своевременно выявить носителей вируса в во время инкубационного периода или бессимптомного течения болезни. В таком случае, ПЦР-диагностика является наиболее точным, чувствительными и высокоспецифичным методом диагностики. Кроме того, благодаря особенностям Real-time PCR возможно определить количественное содержание вируса у отдельно взятого животного.

Для проведения ПЦР-исследования необходимо отобрать биологический материал – это может быть как и кровь, так и ткани внутренних органов. Далее, проводят выделение и очистку ДНК.

Подготовка образцов

Выделение ДНК в общем случае проводят путем разрушения (лизиса) клеток, содержащихся в образце (тем самым, высвобождая в том числе и вирусную ДНК) и очистке полученного лизата от белков, жиров и углеводов. Обеспечивается это обработкой образца поверхностно-активными веществами (например, SDS) или хаотропными агентами (напр. гуанидилтиоцианатом) в присутствии протеиназ. Далее, ДНК пререносят на носитель: к лизату добавляют суспензию ионообемнных шариков, или же его пропускают через ионообменную мембрану, на которые специфически «налипают» молекулы ДНК. Носитель с прикрепленными к нему молекулами ДНК отмывают от клеточного дебриса, после чего элюируют («открепляют») ДНК, с помощью растворителя с низкой ионной силой, чаще всего MQ-водой. На выходе получается высокоочищенный раствор ДНК, пригодный для проведения анализа.

Амплификация

На этапе ПЦР необходимо подобрать специфическую для данного возбудителя пару праймеров – они должны обеспечить амплификацию уникального для данного вируса гена/локуса. В случае, если проводят Real-time PCR, возможно определить количество ДНК вируса в образце. Однако, для того, чтобы оценка количества ДНК вируса была достоверна, необходимо соблюсти ряд условий:

Для анализа необходимо отобрать одинаковый тип и количество биоматериала у всех больных или «подозрительных» животных;

• Забор материала должен быть произведен в одно и то же время;
• Выделение ДНК из образцов должно производиться одновременно и одним и тем же методом (набором реактивов);
• ПЦР для всех образцов необходимо проводить в одинаковых реакционных смесях, на одном и том же приборе;
• Если все образцы невозможно проанализировать за один прогон, протокол анализа на приборе должен быть одним и тем же для всех образцов.

Только при соблюдении всех условий возможно получить достоверные данные.

Если же важно установить только факт наличия возбудителя заболевания у животного, данные условия не обязательны.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Кривая амплификации
Кривая амплификации показывает зависимость флуоресценции репортерного красителя от номера цикла. Реакции различаются по времени, когда возможно обнаружить продукты амплификации. Чем больше изначальное количество ДНК-матриц в исследуемом образце, тем раньше возникнет достаточная для детекции флуоресценция.

Базовая линия
Во время начальных циклов реакции наблюдаются фоновые флуоресцентные сигналы. В соответствие с этим фоном необходимо настроить значение базовой линии.

Дельта Rn
Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии.

Референтный краситель
Краситель, который создает внутреннюю референтную флуоресценцию, по отношению к которой можно нормализировать репортерную флуоресценцию. Нормализация необходима для того, чтобы скорректировать флуктуации, связанные с различиями концентраций компонентов реакционной смеси, объема и особенностей образца.

Эффективность ПЦР
Следующая формула описываю прохождение ПЦР:
Cn=Ci*(1+E)n , где
Ci – начальное количество ДНК-матрицы,
Cn – количество ампликонов на цикле n,
n – количество циклов,
E – эффективность данной реакции.
Если эффективность максимальная (=1), тогда формула приобретет вид Cn=Ci*2n, при этом количество продуктов реакции (ампликонов) будет увеличиваться в 2 раза с каждым циклом. Если эффективность ниже, то каждый цикл ампликоны будут синтезироваться в меньшем количестве, что отобразиться на кривой амплификации. Оптимальная эффективность – от 90 до 110%.

Репортерный краситель
Репортерный краситель связан с 5’-концом зонда TaqMan®. При гибридизации зонда с ДНК-матрицей, этот краситель дает флуоресцентный сигнал, сигнализирующий об успешной гибридизации. Если используется краситель SYBR® Green , то сигнал последует при интеркалляции красителя в двухцепочечеую ДНК, что свидетельствует об успешной амплификации. Специфичность связывания с целевой последовательностью ДНК необходимо проверить по кривой плавления продуктов реакции, либо на гель-электрофорезе.

Rn
Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя.

Пороговое значение (пороговая линия, порог чувствительности)
Это значение ΔRn для CT в данном виде анализа. Порог чувствительности настраивается таким образом, чтобы он был выше базовой линии, но при этом кривая амплификации должна пересекать его в самом начале экспоненциальной фазы.

Пороговый цикл (CT)
Цикл, во время которого кривая амплификации пересекает пороговое значение.