Частота ошибок у tag полимеразы на пару нуклеотидов

Было установлено, что частота ошибок при репликации ДНК Е. coli не превышает 1 на нуклеотидов. Поскольку хромосома Е. coli содержит приблизительно пар оснований, на 10000 клеток, претерпевших один цикл деления, встраивается всего один неправильный нуклеотид.

Долгое время считалось, что столь высокая степень точности воспроизведения генетической информации целиком определяется точностью уотсон-криковского спаривания между матричной и новообразованной (дочерней) цепями, однако в результате последующего анализа выяснилось, что если бы точность репликации зависела исключительно от правильности спаривания оснований, то частота ошибок была бы значительно выше — приблизительно 1 на 104-105 остатков. Следовательно, чтобы объяснить такую низкую частоту ошибок при репликации in vivo, необходимо предположить участие в процессе репликации еще какого-то одного или нескольких факторов.

Более детальное изучение свойств высокоочищенных ДНК-полимераз позволило получить по крайней мере частичный ответ на вопрос о природе этих факторов. Напомним, что ДНК-полимеразы I и III обладают тремя различными ферментативными активностями. Мы уже видели, как фермент функционирует в качестве полимеразы, а также как он может удалять нуклеотидные остатки с 5-конца фрагмента ДНК. Однако 3-экзонуклеазная активность ДНК-полимераз I и III очень озадачивала исследователей, ибо она означала, что эти ферменты способны «пятиться», отщепляя З-концевые нуклеотиды в направлении, противоположном тому, в котором они действуют как полимеразы. З-экзону-клеазная активность ДНК-полимераз I и III — это средство проверки новосинтезированной цепи ДНК и исправления ошибок, сделанных ферментом при его работе в качестве полимеразы. Если ДНК-полимераза встраивает неправильный нуклеотид, то фермент сам может распознать неспособность этого нуклеотида образовать правильную пару с соответствующим нуклеотидом матрицы (рис. 28-15). В этом случае фермент возвращается назад и отщепляет неправильный нуклеотид с З-конца цепи, после чего полимераза продолжает присоединять правильные нуклеотиды, т.е. возобновляет свое обычное продвижение в направлении

Рис. 28-15. Исправление ошибок с помощью 3-зкзонуклеазной активности ДНК-полимеразы.

Таким образом, по мере перемещения репликативной вилки вдоль матрицы осуществляется проверка каждого встроенного нуклеотида. Корректирующее действие ДНК-полимеразы очень эффективно; благодаря ему точность репликации повышается как минимум в 104 раз. Суммарная ошибка возникает в результате ошибок, допускаемых ферментом в ходе полимеризации и в процессе исправления их при корректировке; она не превышает одной ошибки на нуклеотидных остатков.

Очень важно отметить, что процесс репликации протекает со значительно более высокой степенью точности, чем процессы транскрипции и трансляции. Частые ошибки в репликации подвергли бы большому риску сохранность видов и их жизнеспособность.

• Клетки имеют различные механизмы предотвращения возникновения мутаций – необратимых изменений в ДНК

• В процессе синтеза ДНК, большинство ДНК-полимераз «проверяют свою работу» и проводят замену бо́льшей части ошибочно вставленных нуклеотидов. Этот процесс можно назвать исправлением ошибок.

• Сразу после синтеза ДНК любые оставшиеся ошибочные нуклеотиды обнаруживаются и заменяются в так называемом процессе репарации ошибочно спаренных нуклеотидов.

• Если ДНК повреждена, она может быть восстановлена с помощью различных механизмов, например, путём прямой репарации, эксцизионной репарации или путём восстановления двухцепочечных разрывов

  • пострепликативной репарации.

Как ДНК связана с раком? Рак возникает при неконтролируемом делении клеток, когда игнорируются клеточные «стоп»-сигналы, что приводит к образованию опухоли. Это неправильное поведение клеток вызвано накопившимися мутациями — необратимыми изменениями последовательности ДНК клетки.

На самом деле, ошибки в процессе репликации и повреждения ДНК возникают в клетках нашего тела постоянно. Однако в большинстве случаев они не приводят к раку и даже не вызывают мутаций, такие ошибки обычно обнаруживаются и исправляются в процессе репарации ДНК. Если же повреждение исправить не удаётся, то в клетке включается механизм самоуничтожения — (апоптоз), который предотвращает передачу поврежденной ДНК дочерним клеткам.

Мутации возникают и передаются дочерним клеткам только тогда, когда эти механизмы не справляются. В частности, рак возникает в случае накопившихся в одной клетке мутаций генов, связанных с делением.

В этой статье мы подробно рассмотрим механизмы, используемые клетками для исправления ошибок, которые возникают в процессе репликации. К ним относятся:

• Исправление ошибок – процесс, который возникает во время репликации ДНК.

• Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов, которая происходит сразу же после репликации ДНК.

• Механизмы репарации, которые выявляют и исправляют повреждения ДНК на протяжении всего клеточного цикла

ДНК-полимеразы — это ферменты, участвующие в репликации ДНК. Во время копирования ДНК большинство ДНК-полимераз «проверяют», корректный ли нуклеотид они добавляют. Этот процесс называется исправлением ошибок. Если полимераза обнаружит, что был добавлен неправильный нуклеотид, она сразу же удалит и заменит его и только после этого продолжит синтез ДНКstart superscript, 1, end superscript.

Процесс исправления избавляет от основной массы ошибок, но не от всех. После создания новой ДНК запускается механизм репарации ошибочно спаренных нуклеотидов — удаления и замены ошибочно спаренных нуклеотидов, оставшихся в результате репликации. Исправление несоответствий между парами оснований также может включать в себя исправление небольших вставок и делеций, возникающих вследствие «соскальзывания» полимеразы с исходной цепи squared.

Как происходит восстановление неправильно спаренных нуклеотидов? Во-первых, белковый комплекс распознаёт неправильно спаренный нуклеотид и связывается с ним. Другой комплекс разрезает ДНК в области несовпадения, а ещё одна группа ферментов отщепляет некорректный нуклеотид вместе с небольшим участком вокруг него. Затем ДНК-полимераза заполняет этот пробел правильными нуклеотидами, а фермент ДНК-лигаза сшивает разрывы в цепиsquared.

Удивительно: как белки, участвующие в восстановлении ДНК, определяют, «кто прав» во время репарации ошибочно спаренных нуклеотидов? То есть, когда два основания неправильно соединены (как G (гуанин) и T (тимин) на рисунке выше), какое из этих двух оснований должно быть удалено и заменено?

У бактерий можно отличить исходную и дочернюю цепи ДНК по метилированным основаниям. На исходной цепи ДНК есть метильные (minus, start text, C, H, end text, start subscript, 3, end subscript) группы, присоединенные к некоторым из ее оснований, а у дочерней цепи таких групп еще нетcubed.

У эукариот процессы, позволяющие идентифицировать исходную цепь при устранении несоответствий, включают распознавание одноцепочечных разрывов, которые обнаруживаются только у дочерней цепи cubed.

С ДНК может что-нибудь случиться практически в любой момент жизни клетки, а не только во время репликации. Фактически, ДНК постоянно повреждается из-за воздействия внешних факторов: ультрафиолетового излучения и радиации, химических веществ, не говоря уже о спонтанных процессах, которые протекают даже без вмешательства окружающей среды!start superscript, 4, end superscript

К счастью, наши клетки имеют механизмы восстановления, с помощью которых они находят и исправляют большинство повреждений ДНК. Можно выделить несколько типов репарации:

• Прямая репарация. Некоторые повреждения ДНК, вызванные химическими реакциями, могут быть «исправлены» находящимися в клетке ферментами.

• Эксцизионная репарация. Повреждение одного или нескольких нуклеотидов ДНК часто исправляется удалением и заменой поврежденного участка. При эксцизионной репарации оснований удаляется только поврежденное основание. В случае эксцизионной репарации нуклеотидов, как и в случае репарации ошибочно спаренных нуклеотидов, которое мы рассмотрели выше, удаляются целиком нуклеотиды.

• Репарация двухцепочечных разрывов: Существуют два основных способа: негомологичное соединение концов и гомологичная рекомбинация. Они используются для восстановления двухцепочечных разрывов ДНК (когда вся хромосома разделяется на две части).

В некоторых случаях клетка может исправить повреждение ДНК, обратив вызвавшую его реакцию. Дело в том, что «повреждение ДНК» — это, как правило, присоединение к ней лишней группы в результате химической реакции.

Например, гуанин (G) может подвергаться реакции с присоединением метильной (minus, start text, C, H, end text, start subscript, 3, end subscript) группы к атому кислорода в азотистом основании. Если это не исправить, метил-содержащий гуанин будет связываться с тимином (Т), а не с цитозином (С) во время репликации ДНК. К счастью, у людей и многих других организмов есть фермент, который может удалить метильную группу, обратив реакцию, и тем самым вернуть азотистое основание в нормальное состояниеstart superscript, 5, end superscript.

Эксцизионная репарация оснований — это механизм, используемый для обнаружения и удаления определенных типов поврежденных азотистых оснований. Ключевую роль в нем играет группа ферментов, называемых гликозилазами. Каждая гликозилаза обнаруживает и удаляет определенный вид поврежденных оснований.

Например, в процессе реакции дезаминирования цитозин может превратиться в урацил — основание, обычно встречающееся только в РНК. Во время репликации ДНК урацил будет соединяться с аденином, а не с гуанином (в отличие от цитозина), поэтому такое превращение может привести к возникновению мутацииstart superscript, 5, end superscript.

Для предотвращения подобных изменений гликозилаза, являющаяся частью сигнального пути эксцизионной репарации, обнаруживает и удаляет дезаминированные цитозины. После того, как основание было удалено, удаляется и оставшаяся часть нуклеотида, а другие ферменты заполняют пробелstart superscript, 6, end superscript.

Эксцизионная репарация нуклеотидов — это еще один способ удаления и замены поврежденных оснований. В результате нее обнаруживаются и корректируются повреждения, которые искажают форму двойной спирали ДНК. Например, азотистые основания могут измениться, присоединив к себе громоздкие группы атомов, в частности, в результате воздействия химических веществ, содержащихся в сигаретном дымеstart superscript, 7, end superscript.

Эксцизионная репарация нуклеотидов также используется для устранения повреждений, вызванных ультрафиолетовым излучением, например, при получении солнечного ожога. Под воздействием УФ-излучения цитозин и тимин могут вступать в реакцию с соседними основаниями, которые также являются цитозином или тимином, образуя при этом связи, изменяющие форму двойной спирали и вызывающие ошибки в процессе репликации ДНК. Наиболее распространенный тип таких связей — тиминовый димер — он состоит из двух тиминовых оснований, вступающих в реакцию друг с другом и образующих химическую связьstart superscript, 8, end superscript.

При эксцизионной репарации нуклеотидов поврежденные нуклеотиды удаляются вместе с соседними нуклеотидами. В этом процессе хеликаза (фермент, раскручивающий ДНК) раскрывает ДНК, образуя пузырь, а ферменты, разрезающие ДНК, отсекают поврежденную часть пузыря. Полимераза заполняет пробел, а лигаза сшивает разрыв в цепиstart superscript, 9, end superscript.

Некоторые факторы окружающей среды, например, радиация, могут вызывать разрывы обеих цепочек ДНК (разделение хромосомы на две части). Такие повреждения ДНК, если верить комиксам, ведут к появлению супергероев, но могут встречаться и после реальных катастроф, например, Чернобыльской.

Двухцепочечные разрывы опасны, потому что большие сегменты хромосом и сотни содержащихся в них генов могут быть потеряны, если разрыв не будет восстановлен. Существует два способа восстановления двухцепочечных разрывов ДНК: негомологичное соединение концов и гомологичная рекомбинация.

При негомологичном соединении концов два разорванных конца хромосомы просто склеиваются обратно. Этот механизм восстановления является «грубым» и неточным, в результате в месте разрыва, как правило, либо теряются нуклеотиды, либо добавляются лишние, что может привести к мутациям. Но это в любом случае лучше потери целого фрагмента хромосомыstart superscript, 10, end superscript.

При гомологичной рекомбинации для восстановления разрыва используется фрагмент из гомологичной хромосомы, который соответствует поврежденной хромосоме (или из сестринской хроматиды, если ДНК была реплицирована). В этом процессе две хромосомы объединяются, и неповрежденная область гомологичной хромосомы или хроматиды используется в качестве матрицы для замены поврежденной области. Гомологичная рекомбинация работает «чище», точнее, чем негомологичное соединение концов, и обычно не приводит к образованию мутацийstart superscript, 11, end superscript.

Доказательства важности механизмов репарации получены на основе генетических заболеваний человека. Во многих случаях мутации в генах, которые кодируют белки, участвующие в репарации, связаны с наследственным раком. Например:

• Наследственный неполипозный колоректальный рак (также называемый синдромом Линча) вызван мутациями в генах, кодирующих белки, которые участвуют в репарации ошибочно спаренных нуклеотидовstart superscript, 12, comma, 13, end superscript. Поскольку такие нуклеотиды не восстанавливаются, у людей, страдающих этим синдромом, мутации накапливаются гораздо быстрее, чем у здоровых. Это может привести к развитию опухолей толстой кишки.

• Люди с пигментной ксеродермой очень чувствительны к ультрафиолетовому излучению. Это вызвано мутациями в белках, участвующих в эксцизионной репарации нуклеотидов. Когда они не функционируют, димеры тимина и другие виды повреждений, вызванные ультрафиолетовым излучением, перестают восстанавливаться. У людей с пигментной ксеродермой после нескольких минут пребывания на солнце могут возникнуть сильные солнечные ожоги, и около половины из них заболевают раком кожи в возрасте до 10 лет, если только они не избегают солнечных лучейstart superscript, 14, end superscript.